微滴式数字PCR评价保存时间和冻融对细菌基因组DNA稳定性的影响

薛盼盼，张京云

中国疾病预防控制中心 传染病预防控制所，北京 102206

核酸检测技术是目前应用最广泛的微生物检测技术之一[1]，常用于疾病诊断、菌毒株分型和溯源、病原体耐药性和致病力分析等方面。保证核酸的高质量往往是获得可靠检测结果的前提。影响核酸稳定性的因素很多，例如酶促过程、氧化损伤、紫外线辐射和水解等[2]。低温冷冻保存可以延缓核酸水解和氧化作用，因此被作为长期保存标本和核酸的重要手段。反复冻融会加速核酸降解与损伤，因此标本与核酸在冻存过程中要避免反复冻融。但是，每次冻融会对核酸造成多少影响，以及不同保存温度下冻融操作的影响是否有差异，这些都缺少精确定量的数据。

微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是一种可对靶标基因绝对定量的方法，目前在肿瘤学[3]、传染病检测[4]等方面受到关注。ddPCR检测时，反应体系被分散成几万至几百万个有限体积的微滴，每个微滴包含0、1个或几个拷贝的靶标核酸；每个微滴进行独立的PCR反应后，通过计数反应阳性微滴的比例，根据泊松分布原理可计算原始模板浓度[5]。与实时荧光PCR相比，ddPCR对靶标的定量不依赖标准曲线、内参对照和扩增阈值，结果更直观；重复性好，对扩增抑制剂耐受性好，可避免对原始模板浓度评估的偏倚[6]。

我们以纯化的沙门菌和志贺菌基因组DNA为研究对象，用ddPCR方法分析了5个常用的保存温度下，反复冻融和保存天数对2种细菌的靶标基因拷贝数的影响，可为实验室选择适当的核酸保存条件、评估冻存造成的损耗等提供参考。……