鲜切苹果不同部位酶促褐变机理研究

陈 军，鲁 豪

宿州学院生物与食品工程学院，安徽宿州，234000

苹果是人们最受欢迎的水果之一。苹果在受到机械伤害、长期保藏或深加工过程中常会发生酶促褐变，酶促褐变不但会对外观、味道、营养价值及加工性能造成影响，而且还显著缩短保质期。发生酶促褐变的原因是苹果中的氧化酶将多酚氧化成醌，醌类物质接着聚合成为类黑色素，使产品外观颜色改变[1-4]。研究发现，水果中多酚化合物和多酚氧化酶呈现区域化的分布特征，正常情况下水果不易发生褐变，是因为多酚存在于水果和蔬菜的液泡内，多酚氧化酶却存在于质体和细胞质内，没有受到机械损伤的情况下两者不会有接触。鲜切产品在生产和加工过程中遭到机械伤害，改变了酚类物质和多酚氧化酶区域化的分布，导致酶与底物的相遇造成褐变[5-8]。本研究以鲜切苹果为实验材料，通过测定鲜切苹果不同部位褐变度、多酚含量以及相关酶活性，探究鲜切苹果在储存期间各指标的变化规律，为鲜切苹果的储存和保鲜以及苹果的加工和处理奠定理论基础。

1 实 验

1.1 材料与试剂、仪器

1.1.1 材 料

实验材料：红元帅、红富士、阿克苏3种苹果。

1.1.2 试 剂

乙醇； 0.2 mol/L pH 6.5磷酸缓冲液；0.5 mol/L儿茶酚溶液；0.05 mol/L pH 5.5磷酸缓冲液；0.02 mol/L H2O2；0.05 mol/L愈创木酚；50 mmol/L pH 8.8硼酸-硼砂提取缓冲液； 0.02 mol/L L-苯丙氨酸溶液；1 mol/L Na2CO3溶液；0.25 mol/L福林酚试剂(FC试剂)；焦性没食子酸；聚乙烯吡咯烷酮(PPVP)。

1.1.3 仪 器

HH-S恒温水浴锅(济南捷岛分析仪器有限公司)；R-1001LN旋转蒸发器(广州市星灿仪器有限公司)；台式高速离心机H1850(南京晓晓仪器设备有限公司)、UV-5100H型紫外可见分光光度计(济南捷岛分析仪器有限公司)等。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理

将苹果清洗干净，削下果皮并切成1 cm2大小的片状，将果肉切成面积为1 cm2，厚度为3 mm的块状，果核切成碎块，籽去掉。将切好的果皮、果肉、果核分开用聚乙烯保鲜膜密封包装，置于实验室冰箱中贮藏备用。

1.2.2 多酚氧化酶(PPO)活性的测定

称取5.0 g样品放入研钵内，加入0.1 g聚乙烯吡咯烷酮(PPVP)，然后加20 mL 0.2 mol/L pH 6.5磷酸缓冲液，充分研磨至匀浆状态，离心30 min(4000 r/min，4 ℃)，取上清液就是粗酶液。取磷酸盐缓冲液2.5 mL于比色皿中，加入1 mL 0.5 mol/L儿茶酚溶液，加0.5 mL酶液，于410 nm处比色，测3 min内吸光值变化，从加入粗酶液后开始，每经过30 s记录一次OD值，以每分钟吸光度变化0.001所需要酶的量作为一个酶活力单位，测定重复三次[9]。

1.2.3 过氧化物酶(POD)活性的测定

酶提取液的制备与PPO相同。取2.5 mL 0.05 mol/L pH 5.5的磷酸缓冲液、加0.5 mL 0.02 mol/L H2O2、再加0.5 mL 0.05 mol/L愈创木酚，然后加0.5 mL酶液开始反应，于470 nm下测3 min内吸光度的改变。每经过30 s记录一次OD值，以每分钟吸光度改变0.001所需要酶的量作为一个酶活力单位，以上测定均重复三次[9]。

1.2.4 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定

参照曹建康等[10]的方法并对其进行修改。称取5g样品放入研钵内，加20 mL 0.05 mol/L pH 8.8硼酸-硼砂提取缓冲液，研磨至匀浆状态，离心30 min(4 000 r/min，4 ℃)，取上清液就是粗酶液。取0.5 mL酶液，加3 mL 0.05 mol/L pH 8.8的硼酸-硼砂提取缓冲液和0.5 mL 0.02 mol/L L-苯丙氨酸溶液，将反应液放入30 ℃恒温水浴中，0.5 h后用紫外分光光度计测290 nm波长下吸光值的改变。规定每小时290 nm下吸光值变化0.01所需酶的量为一个酶活力单位，以上测定均重复三次。

1.2.5 总酚含量的测定

参考Folin-Ciocalteu法[11]测总酚含量并加以修改。称取10 g样品放入研钵内，加适量Vc和蒸馏水捣碎，再加40 mL 70%乙醇，倒入三角瓶内，然后于50 ℃水浴中搅拌提取30 min，提取液过滤3次，所得上清液于旋转蒸发器中浓缩，回收乙醇，最终所得的就是粗提取物。称取25 mg焦性没食子酸于烧杯中，用蒸馏水溶解，然后转到1000 mL容量瓶内，室温下定容。取7支25 mL的容量瓶，依次向内加入配制好的焦性没食子酸溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL，然后分别加入0.25 mol/L的FC试剂1.0 mL，混匀，加入配制好的1 mol/L Na2CO35 mL定容；30 ℃避光存放，测760 nm处吸光值，一个样品平行测三次，取三次结果的平均值。以焦性没食子酸标准品浓度(μg/mL)作为横坐标，测定的吸光度作为纵坐标建立标准曲线。

向10 mL容量瓶内先加2 mL多酚提取液，然后再依次加入1.0 mL 0.25 mol/L的FC试剂、5 mL 1 mol/L Na2CO3，最后以蒸馏水定容，然后于30 ℃水浴中放置30 min，取出进行冷却，测760 nm下吸光度，对照试验则以蒸馏水替代样品。按照以下公式换算成总酚含量：

ω=(C×V×N)/M

ω为总酚含量(μg/mL)，C为焦性没食子酸的质量浓度(μg/mL)，V为提取液体积(mL)，N为稀释倍数，M为取样量(mL)。

1.2.6 褐变度的测定

参照Min等[12]的方法并略做修改，称取5 g样品放入研钵内，加20 mL 95%乙醇进行提取黑色素，研磨至匀浆状态，在4 ℃，4 000 r/min离心20 min，取上清液放入冰箱中保存以备取用。测定褐变度时，加入提取液到比色皿三分之二处，以95%乙醇作为对照，在420 nm处测其OD值。

2 结果与讨论

2.1 三种鲜切苹果不同部位PPO活性的变化

PPO广泛存在于各种果蔬中，它能够催化各种酚类物质形成醌[13]。当苹果组织受到机械损伤时，PPO能在短时间内快速感应，其活性也会增加。由图1可知，鲜切苹果在贮存过程中各部位的PPO酶活力在前期呈现上升趋势，到了后期阶段则为下降趋势。由图1还可知，鲜切苹果果核的PPO酶活力是各部位中最强的，变化幅度也最大，而果肉的PPO酶活力最弱，变化幅度最小。

图1 三种苹果不同部位PPO活性变化

2.2 三种鲜切苹果不同部位POD活性的变化

POD是一种在水果与蔬菜中非常常见的氧化还原酶，它能够催化过氧化氢和酚类氧化物生成醌类化合物，有利于清除多余的自由基，维持体内正常的自由基动态水平，它被普遍认为是水果和蔬菜中抗氧化代谢的重要指标。从图2中可以得知，鲜切苹果在贮存时期内其各部位POD酶活力也是大致呈前期上升后期下降的变化规律，果核的酶活力最大，果肉酶活力最小。

图2 三种苹果不同部位POD活性变化

2.3 三种鲜切苹果不同部位PAL活性的变化

PAL是苯丙烷代谢途径的关键酶，鲜切水果造成的伤害会诱导苯丙烷代谢的酶系统，从而造成酚类物质的积累和后期组织褐变。由图3可知，在鲜切苹果贮藏过程中各部位的PAL活力的变化均大致呈前期上升后期下降的趋势，且酶活性大小为果核>果皮>果肉。

图3 三种苹果不同部位PAL活性变化

2.4 三种鲜切苹果不同部位总酚含量的变化

从图4得知,苹果果皮中总酚含量最多，果肉中则最少，贮存时期内鲜切苹果各部位总酚含量都是在逐渐减少，果皮中总酚含量前期减少的速度较快。

图4 三种苹果不同部位总酚含量变化

2.5 三种鲜切苹果不同部位褐变度的变化

由图5中可知，贮存期间三种苹果的褐变度大致均为前期上升后期下降，在贮藏中期(第2～4天)褐变度可达到最大。同时从图中可以看出三种苹果果核的褐变度均处于较高的值，果肉则最低。由此可以得出，鲜切苹果在贮藏期间，果核最容易发生褐变，果肉则较不易褐变。

图5 三种苹果不同部位褐变度的变化

2.6 鲜切苹果不同部位PPO、POD、PAL活性与褐变度的相关性

由表1得知，鲜切苹果不同部位PPO、POD、PAL活力都与其褐变度存在一定相关性，其中果皮和果核两个部位PPO活力和褐变度相关系数较大，R2均达到0.8以上，而POD活性与PAL活性与鲜切苹果各部位褐变的相关性均较小。

表1 鲜切苹果不同部位PPO、POD、PAL活性与褐变度的相关性

3 结 语

本研究通过对三个不同品种苹果的果皮、果肉与果核三个部位组织PPO、POD、PAL酶活力、总酚含量以及褐变度进行测定与相关性分析。实验结果显示，鲜切苹果贮存时期内各部位PPO、POD、PAL酶活力以及褐变度大致均在储存前期呈上升后期逐渐下降的趋势，果皮中总酚含量最多，果肉中则最少，各部位总酚含量则一直都在减少。同时得出，鲜切苹果各部位的褐变度大小为：果核>果皮>果肉，所以得知果核最容易褐变，果皮次之，果肉是不易褐变。另外还可以得出鲜切苹果各部位三种酶与褐变度的相关性大小为：PPO>POD>PAL，其中PPO与鲜切苹果果核和果皮褐变度相关性最大。本研究结果可为鲜切苹果加工和贮存中酶促褐变机理研究提供参考。