高温加速陈化贮藏模型中工夫红茶挥发性成分的变化规律

刘亚文，王凯茜，于飞，陈聪，陈淑娜，吕杨俊，朱跃进，孔俊豪，杨秀芳，吴媛媛，何普明，屠幼英，李博

（1.浙江大学农业与生物技术学院茶学系，浙江杭州310058；2.中华全国供销合作总社杭州茶叶研究院，浙江杭州310016）

红茶是世界消费量最大的茶类。工夫红茶作为我国的传统红茶， 香气是其重要的品质评价指标。目前红茶中已知香气成分超过400 种，香型有薯香、花香、果香、甜香等多种类型[1]。和其他茶类一样，红茶在贮藏过程中，其内含成分和感官风味受外界因素（温度、湿度、氧气、光照、时间等）影响而改变，若贮藏不当会加速降低红茶品质，造成汤色浑浊，香气和滋味寡淡[2]。茶叶中的风味化学物质多是热敏物质， 在贮藏过程中温度的影响尤为显著[3]。

生产中多通过人工审评对茶叶香气进行定性分析，但存在主观性大、容易受外部因素干扰等问题。通过定量分析借助统计模型能够对茶叶香气进行更加全面的描述和评价[4]。如通过对兰花香及板栗香绿茶香气及工夫红茶香气的定量描述分析模型， 能对茶叶香型进行更为准确的定义和评价[5]。李俊等[6]采用固相微萃取气相色谱质谱联用技术， 对贵州各产区红茶的主要呈香物质和关键差异香气成分进行定量分析， 结果与感官审评所得的甜香、花香和高香结论基本一致。

目前与绿茶、白茶、黑茶相比，对红茶品质劣变的研究相对较少， 特别是对其挥发性成分贮藏变化规律的研究更为缺乏[7]。研究以祁红和滇红两种典型工夫红茶为研究对象， 采用高温加速陈化贮藏模型， 研究工夫红茶贮藏过程中挥发性成分的变化；利用多元变量分析寻找关键香气化合物，以期为了解红茶香气品质在贮藏中的变化规律提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

祁门红茶，购自祁门县双辉源茶厂，祁门槠叶种，手工采摘，茶叶等级一级，生产日期为2018年4月19 日；云南大叶种红茶，购自云南凤庆茶厂，茶叶等级一级，生产日期为2018年7月2 日。

1.2 仪器与设备

GCMS-QP2010SE 气相色谱-质谱联用仪（日本Shimadzu 公司），SH-Rxi-5Sil MS 气相色谱柱（日本Shimadzu 公司），SPME 手动进样手柄与50/30 μm DVB-CAR-PDMS 纤维萃取头 （美国Supelco 公司），DK-S28 电热恒温水浴锅 （上海三发科学仪器有限公司），AL104 电子天平 （瑞士Mettler toledo 公司），20 mL 精密螺纹玻璃瓶（德国CNW 科技公司），UV759S 紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），5804R 离心机（德国Eppendorf 公司），Venticell 111 烘干机 （德国MMM 公司），分光测色仪（美国HUNTERLAB 公司）， 智能光照培养箱 （宁波海曙莱福实验仪器厂）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品贮藏

将祁红、滇红两种不同茶样无包装散放，分别置于40 ℃、50 ℃恒温恒湿培养箱中（±0.1 ℃），避光贮存，培养箱相对湿度为30%～35%，分别于1、2、4、6、8、10 周取样检测。对照为室温条件下无包装散放的两种茶样，避光贮存。

1.3.2 香气检测

茶样从恒温培养箱中取出后立即处理检测。将2 g 未经研磨茶样，以茶水比1∶3 向萃取瓶中注入沸水，密闭后放入60 ℃水浴中平衡5 min，插入已老化的萃取头， 在60 ℃水浴中顶空吸附60 min，之后立即进行GC-MS 分析。

GC 条件：气相色谱柱为HP-INNOWAX 毛细管柱 （30 m，0.25 mm，0.25 μm）， 进样口温度为250 ℃，进样后在250 ℃下解吸附3 min，载气为高纯He（纯度＞99.999%），柱流速1.0 mL/min，进样方式为手动无分流进样。升温程序：50 ℃保持5 min，以3 ℃/min 上升至210 ℃，保持5 min，再以15 ℃/min 上升至230 ℃，保持5 min，总时间为69.67 min。

MS 条件：电离方式为EI，离子源温度为230℃，电子能量为70 eV，扫描范围为20～500 amu。电子倍增管电压为1500 V， 总离子流强度为100 Ma[8]。

香气物质分析： 将采集到的总离子色谱图进行积分，得到的各组分在NIST17 质谱库中进行检索，筛选出匹配度大于85%的化合物，经鉴定后采用面积归一法计算各香气成分相对含量。

1.4 统计分析

数据结果以“平均值±标准差”的方式表示，采用SPSS 26.0 进行方差分析，SIMCA-P 14.1 软件进行正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis OPLS -DA），Origin pro 2017 制作折线图和热点图。

2 结果与分析

2.1 祁红和滇红在高温加速陈化贮藏模型中香气物质种类的变化

茶叶香气表现是各种挥发性成分综合作用的结果，是衡量茶叶品质的重要因子之一。红茶具有独特香型特征，香气组分种类较多，包括碳氢化合物、醇类、酮类、酸类、醛类、酯类、酚酸类、过氧化物类、含硫化合物类、吡啶类、吡嗪类等，其中醇类、醛类、酯类构成了祁红主要的香气物质来源[9]。醇类化合物主要有脂肪族醇、 芳香族醇和萜烯醇3 大类， 具有花果香的萜烯醇是红茶香气中的重要成分。醛类化合物主要呈现花香或清香，而红茶清香的形成主要与发酵程度有关。酯类化合物在红茶中含量也相对较高，多呈花香[10]。祁红和滇红贮藏10 周后，醇类、醛类、酯类相对含量整体呈现下降趋势，且在50 ℃时下降速率大于40 ℃，表明相对高温下贮藏不利于香气的保持见表1。

表1 在高温加速陈化贮藏模型中祁红、滇红香气物质种类的相对含量变化（单位：%）Table 1 Change of aroma types of Keemun Black Tea and Yunnan Black Tea under the high temperature accelerated storage model （Unit：%）

2.2 OPLS-DA 模型分析不同贮藏条件下与初始茶样香气的差异

为探究具体香气成分在工夫红茶贮藏过程中的变化，采用OPLS-DA 模型分别研究祁红和滇红在不同贮藏条件下与初始茶样香气的差异。用VIP 值评价香气成分对模型的贡献度，VIP 值越大说明贡献越大，以VIP 大于1 为筛选阈值。

2.2.1 祁红不同温度贮藏10 周后的香气成分分析

采用OPLS-DA 模型对初始、无包装自然存放10 周后、40 ℃贮藏10 周后、50 ℃贮藏10 周后祁红茶样香气进行分析，得分图如图1A 所示。贮藏后，自然存放和初始茶样的散点距离最近，代表其相较于初始茶样香气变化最小。40 ℃和50 ℃贮藏后的散点距离初始距离都较远， 说明高温加速陈化会使香气成分发生较大的改变，且50 ℃散点距离初始的距离更远一些， 说明贮藏温度高对香气成分改变更大。40 ℃和50 ℃散点分布在坐标轴的不同象限， 表明它们的香气成分种类区别较大，不同温度下贮藏会产生不同的香气物质。

图1B 显示， 该OPLS-DA 模型中VIP 大于1的共有64 种成分，其中香叶醇、β-紫罗兰酮、苯甲醛、正己醛、芳樟醇及其氧化物、苯乙醇等均属于祁红特征性香气。进而单独比较了在40 ℃和50℃下贮藏10 周后，祁红相对于初始茶样的香气化合物变化，见表2，40 ℃贮藏10 周后有37 种香气化合物VIP 值大于1，27 种VIP 值小于-1；50 ℃贮藏10 周后有43 种化合物VIP 值大于1，38 种VIP 值小于-1。芳樟醇、香叶醇、雪松醇、苯甲醇、苯乙醛、水杨酸甲酯、紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯等香气特征物质相对含量降低， 烷烃类物质相对含量增加，但后者对香气感官的贡献度较低。

据报道，祁红中相对含量较高（相对百分含量大于3%） 的香气成分主要是香叶醇（阈值为3.2 ng/g）、苯乙醛（香气阈值为4 μg/kg）、芳樟醇及其氧化物（香气阈值为6 ng/g）、苯甲醇（香气阈值为0.62 mg/ kg）和水杨酸甲酯[11]。香叶醇具有温和、甜的玫瑰花气息，是甜香的主要物质基础；氧化芳樟醇具有清甜的玫瑰花气息；芳樟醇既有紫丁香、铃兰与玫瑰的花香，又有木香、果香气息，是玫瑰香、果香的主要物质基础[12]。苯乙醛具有浓郁的玉兰花香气，是构成祁红清鲜、果香的特质基础，也是祁红的特征香气成分[13]。水杨酸甲酯具有特殊的冬青叶味和薄荷味， 是促进茶叶形成果香气味的重要物质。橙花醇是香叶醇的异构体，具有令人愉快的玫瑰和橙花的香气，较平和、微带柠檬样的果香，橙花醇香气比香叶醇柔和优美[14]。研究通过OPLS-DA 模型筛选，进一步重点分析了变化显著的祁红典型香气成分在整个贮藏过程中的变化趋势，包括苯甲醛、2-己烯醛、苯乙醛、橙花叔醇、苯乙醇、苯甲醇、水杨酸甲酯、香叶醇、芳樟醇等9 种特征性香气物质。通过热点图图1C 记录贮藏1、2、4、6、8、10 周上述香气含量可直观发现， 苯甲醛、苯乙醛、苯甲醇、芳樟醇在不同贮藏温度下均出现了先升高后降低的情况， 这可能也是贮藏初期感官品质上升的部分原因。

2.2.2 滇红不同温度贮藏10 周后的香气成分分析

OPLS-DA 模型得分图图2A 显示，对初始、无包装自然存放10 周后、40 ℃贮藏10 周后、50 ℃贮藏10 周后滇红茶样香气进行分析，和祁红的实验结果大致一致， 自然存放的香气变化最小，40 ℃和50 ℃贮藏下香气成分变化较大，其中50 ℃贮藏变化更大。40 ℃和50 ℃贮藏产生的香气成分差异较大。从得分图散点的分布区域来看，祁红和滇红在高温贮藏后产生变化的香气成分种类较一致。在滇红OPLS-DA 模型的香气模型中 （图2B），VIP 大于1 的共有70 种成分， 其中香叶醇、水杨酸甲酯、苯乙腈、苯甲醛、柠檬醛、芳樟醇及其氧化物、α-紫罗兰酮、苯乙醇等均属于滇红特征性香气成分，对滇红品质具有较大贡献。进而单独比较了在40 ℃和50 ℃贮藏10 周后相对于初始滇红茶样的香气化合物变化， 如表3 所示，40 ℃贮藏10 周后有30 种香气化合物VIP 值大于1，24种VIP 值小于-1；50 ℃贮藏10 周后有31 种化合物VIP 值大于1，28 种VIP 小于-1；香叶醇、芳樟醇及其氧化物、水杨酸甲酯、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、苯乙醇、橙花醇这些特征性香气物质相对含量明显减少， 与香气品质负相关的1-甲基萘、烷烃类物质相对含量增加。

云南工夫红茶主要香气物质的组成包括醛类如正己醛、糠醛、青叶醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、苯甲醛、苯乙醛等，芳香族醇类如苯甲醇、苯乙醇类，萜醇类如芳樟醇、芳樟醇氧化物、α-松油醇、香叶醇等，酯类如β-紫罗兰酮、内酯类如二氢猕猴桃内酯等， 这些香气化合物是构成云南红茶香气特征的主要物质基础[15]。凤庆红茶产于云南凤庆县，其芳樟醇含量较高[16]。通过OPLS-DA 模型筛选， 进一步分析变化显著的滇红典型香气成分在整个贮藏过程中的变化趋势，包括水杨酸甲酯、β-紫罗兰酮、香叶醇、α-松油醇、芳樟醇、苯乙醇、苯甲醇、苯甲醛、正己醛9 种特征性香气物质。通过热点图（图2C）记录贮藏1、2、4、6、8、10 周上述香气含量发现除β-紫罗兰酮外，其他8 种香气成分在不同贮藏温度下均出现了先升高后降低的趋势， 表明这些化合物可能都对滇红贮藏前期感官品质的提高有一定贡献。

3 结论

香气作为工夫红茶品质特征的重要评价指标，已受到越来越多的关注[17-18]。以祁红和滇红作为工夫红茶的代表研究对象， 通过高温加速陈化模型， 研究40 ℃和50 ℃高温贮藏条件下香气的变化。结果表明在贮藏过程中工夫红茶香气成分发生显著变化，贮藏10 周后醇类、醛类、酯类相对含量整体呈下降趋势。但在贮藏过程中，苯甲醛、苯乙醛、苯甲醇、苯乙醇、芳樟醇、水杨酸甲酯、香叶醇、α-松油醇、正己醛等和品质正相关的香气成分的相对含量都有先升高后降低的趋势。这可能可以部分解释工夫红茶的香气品质在贮藏初期有所上升，之后又下降的现象。研究为今后探讨工夫红茶在不同贮藏条件下香气成分的变化规律提供参考。

图1 贮藏后祁红的香气成分OPLS 分析Fig. 1 Aroma OPLS analysis of the Keemun Black Tea after storage

表2 贮藏后祁红和初始茶样比较的香气贡献VIP 表Table 2 VIP plot for the volatile compound contribution of the initial and storaged Keemun Black Tea

图2 贮藏后滇红的香气成分OPLS 分析Fig. 2 Aroma OPLS analysis of the Yunnan Black Tea after storage

表3 贮藏后滇红和初始茶样比较的香气贡献VIP 表Table 3 VIP plot for the volatile compound contribution of the initial and storaged Yunnan Black Tea