鸡新城疫红细胞凝集抑制试验操作注意事项

益 莎

（东营市东营区畜牧业发展服务中心，山东 东营257091）

血凝抑制试验（Hemagglutination inhibition test，HI）是鸡新城疫抗体实验室检测中最常用的方法，可用于新城疫疫苗免疫后的效果评估及临床疑似病例的辅助诊断，因其操作简便、成本低，可进行大量样本的高通量快速检测，在基层实验室中广泛应用。但影响血凝抑制试验结果的因素众多，如红细胞新鲜程度、抗原种类、稀释液的种类、血清质量、环境温度和作用时间等，需要注意各种操作细节，操作时注意力应高度集中，避免漏加和重复加样，方能得到最准确的结果，否则可能得出错误结果，给养殖户造成一定的经济损失。笔者结合自己多年工作经验，对操作过程中需要注意的事项归纳总结如下。

1 稀释液配制

稀释液可采用0.85%的生理盐水，也可用磷酸盐缓冲液（PBS），通常PBS酸碱缓冲能力好，测出的结果更接近真实情况，更准确。但PBS配制相对复杂，且保存时间短、不稳定，容易出现絮状沉淀，检测中常用的是pH值7.2 、浓度0.01 mol·L-1的PBS，配制方法为氯化钾0.2 g、氯化钠8.2 g、磷酸二氢钠0.24 g、磷酸氢二钠1.44 g，加去离子水1000mL，搅拌溶解充分混匀，调节pH值至7.2，分装后121℃高压灭菌15min，室温保存备用。严格控制PBS的pH值，否则可能会导致自凝或吸附于红细胞上的病毒脱落，建议条件不好的基层试验室选用生理盐水做稀释液，配制简单、方便，即使不会配也可以购买医用商品化试剂，相对稳定可靠，对试验结果几乎无任何影响。

2 红细胞悬液制备

制备红细胞悬液是要选用SPF鸡或健康非免疫鸡，多选几只鸡，采集的血液混合，也可选用免疫过疫苗的淘汰鸡，但洗涤红细胞时一定要多洗几遍。抗凝剂可采用自己配制的阿氏液。配制方法：在100mL去离子水中加入葡萄糖2.05 g、氯化钠0.42 g、柠檬酸0.055 g、柠檬酸钠0.8 g，搅拌溶解，调节溶液pH值为6.1，高压灭菌后4℃保存备用，3个月内用完。使用时阿氏液与抽取血液的最终比例为1∶1。红细胞洗涤时选用“V”型尖底15mL离心管，加约4倍稀释液，吸管轻吹混匀后3000r·min-1离心5min，反复洗涤3次以上。吸取红细胞时吸管插到底部，不要吸取表层，配制浓度一般为1%，浓度偏低时测得的血清血凝抑制效价偏低，浓度偏高时测得的血清血凝抑制效价偏高，离心转速不要太高，吹吸红细胞操作不要太剧烈，否则可能造成红细胞破裂溶血，同一试验用同一批红细胞。也可使用医用抗凝采血管，采集鸡血液时一定要充分混匀，防止血液局部凝集。配制的红细胞悬液最好当天使用，时间不要超过3d。

3 4 单位凝集抗原配制

4单位血凝抗原的配制浓度是影响试验结果准确性的重要环节，浓度偏高时测出的结果偏低，浓度偏低时测得的结果偏高。4单位抗原最好现用现配，配制后室温下4h内用完，切记不要反复冻融，以免影响抗原效价。同次试验或同批次试验用相同的4单位抗原，效价高的浓缩抗原稳定性和效果更好。每次使用前要吹吸摇匀，加样后振荡。疫苗免疫效果检测时最好选用疫苗厂家提供的抗原配制4单位血凝抗原，不同毒株测出的抗体效价不同，最多可差2～3个效价。

4单位抗原配后的验证方法：将25μL4单位抗原等量倍比稀释，使每孔含有4、2、1、0.5 个血凝单位，再加等量人红细胞悬液，判定结果。4、2、1个血凝单位孔红细胞出现完全凝集为合格。鉴于影响血凝抑制反应的因素众多，某些基层实验室的4单位抗原需多次调整，费心费力，个人认为对试验结果没有太大影响的情况下可根据实际情况适当提高4单位抗原浓度，以提高工作效率。

4 器材的选择和使用

血凝板常选用一次性V型96孔板，90°或110°均可以，反应板形状规则，无漏洞褶皱，清洁、光滑。如采用可重复利用的旧反应板时，一定要保证清洗干净并烘干。加样时应加入到板底部，不可加的太慢，不要溅出。

所用移液器要定期检定校准，用后调回最大量程，配备适宜吸头，保证安装牢固，避免漏气。吸取液体时轻轻的反复吹吸，防止气泡的产生，用力均匀，防止移液量不准。吸取时应做到“慢吸快打”，防止移液器吸入液体，从而腐蚀柱塞致漏气。加样前应先吸取溶液1次，湿润吸头，防止因吸头内壁残留的“液膜”造成排液量小的误差。加4单位抗原或红细胞时，吸头垂直加入液体，并保持管嘴与凝集板孔间的距离，防止样品间交叉污染。先加低浓度抗原孔，再加高浓度孔，保证每个孔内加入液体量准确无误。加样完毕后，把移液器调回最大量程，并定期校验，避免结果不准。

一定要选用一次性吸头，切记重复利用。吸头不要触碰到无关的V型板孔，以免发生交叉污染。振荡器工作时应匀速平稳、无异常抖动，幅度不宜过大，时间不能太长，一般10s左右。用校准的水银温度计定期校验恒温箱，保证控温准确。

5 检测样品的准备

抗体检测样品可以是血清和鸡蛋，因采血对鸡应激过大，临床送检样品以鸡蛋居多，测定卵黄抗体。采样要合理，采典型样品，保证无菌操作，采样量适量。通常按鸡群3%的比例随机抽样，最低不要少于30份，否则检测结果不具有代表性。血清检测辅助疾病诊断时应病死鸡与正常鸡兼顾，死亡鸡可从心房中取血凝块，分离血清检测。为保障检测结果，通常在鸡进食前采血，待检血清需新鲜、无杂质、不溶血、无腐败，盛装容器要清洁，正常鸡血清状态为清亮透明或微黄色。穿刺方法要正确，注入容器时，取下针头缓慢注入，避免大量泡沫产生，导致溶血。送至实验室后要立即分离血清，暂时不能分离时，样品要冷藏保存。温度在23℃以上时，血清可在2h内析出，如果采血时外界环境中温度低于10℃，血样采集后置保温箱中，切记不让样品冻结，待血清析出后5000r·min-1离心5min。有时会出现胶冻样血清，可用加样枪头将胶冻样血清在离心管壁上挤压几下或戳破血再离心。血清忌反复冻融，3d内使用，可4℃保存，长期冻存于-20℃。

对产蛋鸡而言，通常测卵黄抗体效价代替测血清效价，以减少采血对鸡的应激。通常卵黄较血清低1～2个效价，因卵黄的形成需要9～10d的时间，卵黄抗体较血清中抗体的检测结果有一定滞后性，鸡抗体上升期，不可用卵黄代替血清进行抗体监测。卵黄萃取和直接稀释所得检测结果基本一致，可同时取异常蛋和正常蛋检测卵黄抗体。

6 试验的温度和结果观察时间

温度对试验结果有一定影响，温度高出现结果的速度快，凝集解脱也快。温度每提高5℃测得抗体效价平均上升0.35 lg。4℃时红细胞发生自凝，37℃以上时产生凝集的红细胞易洗脱。当室温为20～25℃，时间一般在30～40min。环境温度过低时放入37℃恒温培养箱中。反应板远离风扇、空调或风机出风口，以免液体挥发影响结果。红细胞悬液加入后，待对照红细胞悬液完全沉淀前后5min内判定结果为宜，时间早则不能反映实际抗体水平，时间迟则红细胞易发生溶血，导致试验无效，故凝集板应静置到规定时间后观察结果，中途不能随时取放。

7 小 结

新城疫抗体检测的红细胞凝集试验方法是应用最广的方法，尤其在基层兽医检测部门。虽然看似简单，但要想真正做好，得到真实结果并不容易，有很多细节性的问题需要注意，需要经验丰富人员长期实践摸索，需要人员高度认真负责。抗体测定时要连续测对样品结果，根据抗体变化情况综合评估分析，方能得出能对临床生产具有指导意义的数据。试验过程中所用一切稀释液、红细胞悬液、4单位抗原要正确配制，尤其是4单位抗原和红细胞悬液等，加样时摇匀，避免样品分布不均造成结果偏差，保证每一次试剂加入准确无误，操作手法一定要标准，减少各种误差，争取检测结果准确、可靠。总之，整个试验过程一定要注意操作的各方面细节，才能得到最准确的结果。