啤酒酵母酿造葡萄酒及香气成分GC-MS分析研究

刘永衡，陈 彬，王学英

（宁夏工商职业技术学院能源化工学院，宁夏银川 750021）

香气是葡萄酒品质的一项重要指标，其产生主要来自于酿酒葡萄品种、酵母以及工艺等因素的综合作用下，世界著名产地的葡萄酒都有着自己独特的香气特征。酵母作为赋予葡萄酒香气特征的主要因素之一，不同酵母发酵产生的代谢产物很大程度影响着葡萄酒感官特征以及消费者喜好[1]。酵母菌的主要作用是催化糖类转化为酒精，但除了酒精之外，酵母菌对最终的产品品质也有着贡献，例如香气成分[2]。大量研究表明，酵母及其他微生物在葡萄酒香气产生中的作用毋庸置疑[3-5]。酵母菌主要以两种方式影响葡萄酒的香气成分：一种是从头产生香气成分，另一种是通过修饰来自于葡萄的某些前体化合物产生[6]。选择合适的酿酒酵母对于葡萄酒发酵非常重要，合适的酵母可以为葡萄酒带来更加优异的风味表现。

啤酒酵母除用于酿造啤酒、酒精及其他的饮料酒外，还可发酵面包[7]。啤酒酵母按照发酵状态可分为上层酵母（又称为艾尔酵母）和下层酵母（又称为拉格酵母）。目前国内外尚无有关于啤酒酵母酿造葡萄酒的报道，利用啤酒酵母酿造果酒的报道仅见于张宝善等[8]利用啤酒酵母酿造石榴果酒的工艺研究。本研究中采用的弗曼迪斯清香高沉淀型拉格啤酒酵母S-189，其属于下层酵母，具有发酵活力高、耐低温的特点。利用啤酒酵母S-189单发酵、葡萄酒酵母单发酵以及S-189、葡萄酒酵母混菌发酵葡萄酒，采用顶空固相微萃取（head space-solid phase microextraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析其香气成分差异，旨在为啤酒酵母、混菌酿造葡萄酒提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

黑比诺葡萄、梅鹿辄葡萄：宁夏西夏王葡萄酒业（集团）有限公司；S-189啤酒酵母：宁夏工商职业技术学院能源化工学院微生物实验室保存；葡萄酒酵母F1：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 试剂

乙酸乙酯（色谱纯）：美国Fisher公司；2-辛醇标准品（纯度＞99.5%）：美国Sigma公司；无水硫酸钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；焦亚硫酸氢钾（分析纯）：上海罗恩试剂公司；EX-V果胶酶：法国拉曼公司。

1.2 仪器与设备

7890B-5977B气相色谱-质谱联用仪：美国安捷伦科技有限公司；顶空固相微萃取纤维头DVB/CA/PDMS（2 cm，50/30 μm）：美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄酒酿造工艺流程

操作要点：采用黑比诺葡萄、梅鹿辄葡萄（1∶1比例）为酿酒原料，除梗破碎后加入焦亚硫酸氢钾60 mg/L，果胶酶20 mg/L，浸渍24 h后加入活化酵母（S-189啤酒酵母用5%蔗糖水在25 ℃活化2 h，F1葡萄酒酵母用5%蔗糖水在37 ℃活化30 min），发酵方式为啤酒酵母S-189单独发酵（SY）（发酵温度为10 ℃）、葡萄酒酵母F1单独发酵（AY）（发酵温度为20 ℃）和混菌发酵（MY）（酵母S-189和F1 1∶1比例添加[9]，发酵温度为10 ℃），酵母添加后每隔6 h测一次温度及比重，待比重降到0.992～0.996时并维持不变后即为主发酵结束，随后进行皮渣分离，原酒分离后采用自然发酵的方式进行苹果酸-乳酸发酵，结束后添加焦亚硫酸氢钾60 mg/L，倒罐降温冷藏澄清，过滤机过滤，得到葡萄酒贮存备用。

1.3.2 GC-MS分析条件

（1）葡萄酒样前处理

采用顶空固相微萃取（HS-SPME）方法进行前处理，取葡萄酒样5 mL于15 mL顶空瓶中，加入1 g氯化钠、5 μL内标物2-辛醇（稀释比例1∶200）和磁力转子后迅速拧紧瓶盖，将萃取头插入样品顶空瓶，置于磁力搅拌器于60 ℃吸附30 min。吸附后将萃取头取出插入气相色谱进样口，于200 ℃解吸5 min，进样量1 μL[10]。

（2）葡萄酒样GC-MS检测条件

气相色谱条件：色谱柱为HP-INNO-Wax毛细管柱（30.0m×0.25 mm×0.25 μm），载气氦气（He）（纯度99.99%），流速1.10 mL/min；进样口温度200 ℃；升温程序：35 ℃保持3 min，以4 ℃/min的升温速度升至120 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的升温速度升至230 ℃。

质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，传输线温度250 ℃，电子能量70 eV，光电倍增管电压350 V，质量扫描范围30～350 amu。

定性方法：由GC-MS分析得到的质谱数据经计算机在美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）17标准谱库检索及WILEY质谱图库比对，谱库比对时要求匹配度＞700，定性鉴定出大部分峰。

定量方法：葡萄酒样采用内标法进行半定量分析，内标为2-辛醇；待测香气成分定量分析计算公式为：香气组分的含量（μg/L）=[（各组分的峰面积/内标峰面积）×内标质量（μg）]/样品体积（L）。

1.3.3 香气活力值分析

气味活力值（odor activity value，OAV）是评价香气成分对饮料、酒以及其他食品物质香气的贡献指标，样品中OAV＞1的香气成分是样品香气特征的主要来源。OAV=香气物质浓度/香气物质阈值，根据文献[11-13]查找每个香气物质在葡萄酒中的阈值，计算各个香气成分的OAV，并统计OAV＞1的香气物质，表征各个香气物质对葡萄酒样品香气贡献的大小。

1.3.4 分析检测

（1）感官指标

参照GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[14]以及李华《葡萄酒品尝学》[12]，由8名专业人员从外观（10分）、香气强弱（30分）及滋味（40分）、典型性（20分）四个方面综合评价，满分100分，每个样品随机编号盲品3次求平均值。

（2）理化指标

酒精度、总酸度、还原糖、总SO2含量检测参照国标GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，其中酒精度采用酒精计法；总酸度采用酸碱滴定指示剂法，结果以酒石酸计；还原糖采用直接滴定法，结果以葡萄糖计；总SO2采用直接碘量法，结果以游离SO2（mg/L）计；单宁参照李华[15]《葡萄酒分析检验》中的福林-丹尼斯法。

2 结果与分析

2.1 葡萄酒感官指标分析

如图1所示，AY葡萄酒在外观评定上的得分最高，其次为MY葡萄酒，SY葡萄酒最低；香气、滋味、典型性等项目得分顺序均表现为MY葡萄酒＞SY葡萄酒＞AY葡萄酒；最终综合评定表示MY葡萄酒风味最佳，SY葡萄酒风味其次，以啤酒酵母或混菌酿造葡萄酒风味较为独特。

图1 SY、AY、MY发酵方式酿造葡萄酒感官评价Fig.1 Sensory evaluation of wines produced by SY,AY and MY fermentation mode

2.2 葡萄酒基本理化指标分析

酿造葡萄酒储存40 d后，取3种葡萄酒进行理化指标检测，结果见表1。由表1可知，SY、AY、MY葡萄酒的理化指标均满足国标GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》要求，并且MY葡萄酒的理化指标优于SY、AY葡萄酒。

表1 SY、AY、MY发酵方式酿造葡萄酒酒样基本理化指标Table 1 Basic physical and chemical indexes of wines produced by SY,AY and MY fermentation mode

2.3 葡萄酒样GC-MS检测结果分析

葡萄酒样SY、AY及MY中香气成分的GC-MS总离子流谱图见图1，经标准谱库检索比对，葡萄酒样SY、AY及MY中各组分鉴定分析结果分别见表2。

图2 SY（A）、AY（B）及MY（C）发酵方式酿造葡萄酒样香气成分GC-MS分析总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of aroma components in wines produced by SY (A),AY (B) and MY (C) fermentation mode analysis by GC-MS

表2 3种葡萄酒样香气成分GC-MS分析结果Table 2 Aroma components in 3 kinds of wines analysis by GC-MS

续表

由图2、表2可知，3种葡萄酒样品共检出34种挥发性香气成分，SY葡萄酒样GC-MS分析检测总共鉴定出15个化合物，其中醇类化合物总计6种，含量最高的为3-甲基-1-丁醇（4 906.83 μg/L）；酯类化合物总计9种，含量最高的为山梨酸甲酯（1 419.38 μg/L）；AY葡萄酒样GC-MS分析检测总共鉴定出20个化合物，其中醇类化合物总计6种，含量最高的为3-甲基-1-丁醇（6 030.48 μg/L）；酯类化合物总计5种，含量最高的为乙酸苯乙酯（833.28 μg/L）；有机酸类总计4种，含量最高的为辛酸（2 607.05 μg/L）；此外还鉴定出2-庚酮、苯甲醛、β-紫罗兰酮、丁子香酚、胡椒醛等其他5种化合物；MY葡萄酒样GC-MS分析检测中总共鉴定出22个化合物，其中醇类化合物总计5种，含量最高的为3-甲基-1-丁醇（18 590.83 μg/L）；酯类化合物总计12种，含量最高的为2,4-己二烯酸乙酯（1 711.98 μg/L）；有机酸类总计4种，含量最高的为辛酸（1 439.61 μg/L）；此外也鉴定出化合物胡椒醛。SY和MY两种葡萄酒中醇类化合物含量所占比例均最高，其次为酯类化合物；AY中醇类化合物含量所占比例最高，其次为有机酸类化合物，最后为酯类化合物。

2.2 葡萄酒样OAV分析

由表3可知，三个样品中总计有6种特征香气组分（OAV＞1），其中包括5种酯类化合物和1种有机酸化合物；SY、AY、MY样品中OAV＞1的香气化合物分别有3、3、4种，SY样品特征香气组分全部为酯类，其中OAV最大的香气组分为辛酸乙酯；AY、MY样品特征香气组分除了酯类还有有机酸，其中OAV最大的香气组分都为己酸乙酯。

表3 三种葡萄酒样OAV值大于1的香气物质Table 3 Volatile compounds (OAV＞1) in 3 kinds of wines

3 讨论

本研究表明采用两种酵母混菌发酵相对于酵母单发酵葡萄酒香气物质种类有所增加，三个葡萄酒样品含量最高的化合物均为异戊醇；这与他人的研究成果一致，例如赵现华等[16]研究了共发酵对蛇龙珠葡萄酒香气成分的影响，最终共检出39种挥发性成分，其中异戊醇含量最高；且两种酵母共发酵相比较于单酵母发酵香气成分、含量都有所增加。胡雪莲等[17]研究了四株啤酒酵母的酿造特性以及其酿造的啤酒中的风味物质，发现在四种啤酒中醇类风味物质含量最高的都是异戊醇。然而，从香气成分种类数量来看，相对于已报道的其他葡萄酒香气成分，三个样品香气成分种类明显较少。例如姚瑶等[18]从4个产区的赤霞珠干红葡萄酒鉴定出91种香气成分，4个样品分别鉴定出29种、30种、49种、50种香气成分。余欢等[19]利用不同的7株酵母酿造葡萄酒，GC-MS共检测到68种香气成分，其中每个样品检测到50种左右香气成分；冯涛等[20]葡萄园土壤中分离到4株酿酒酵母并分别用于发酵葡萄酒，从酿造的4种葡萄酒共检测到45种香气成分，其中每个样品检测到35种左右香气成分；三个样品中检测出的香气成分较少的原因极大程度上可能与发酵温度较低有关，SY、MY样品发酵温度为10 ℃，而AY样品为20 ℃，发酵温度均低于上述文献中的葡萄酒。另外，SY样品未检测到挥发酸，挥发酸是葡萄酒香气成分中经常能够检测到的成分，例如乙酸、己酸等，对于葡萄酒香气风味有一定的影响[21]，推测SY样品未检测到挥发酸可能是采用啤酒酵母、酸类成分含量太低等原因。有些酵母菌（特别是德尔布鲁克氏酵母，一种啤酒酵母）在发酵过程中产生的酸类会明显减少[22]，这也可能是SY样品风味相对于AY、MY样品较为独特的原因，OAV分析也显示，AY、MY样品香气特征除了酯类的香气贡献外还有有机酸类的贡献；近年来，人们对混菌发酵越来越关注，大量的研究表明，混菌发酵可以产生更多的香气，尤其是构成酒体香气主要成分的酯类[23-26]；混菌发酵可以是两种酿酒酵母，也可以是一种非酿酒酵母和一种酿酒酵母混合发酵，这种共培养可以引起香气特征的改变，以及相对较低的乙醇含量[27-28]。本实验的研究成果与上述研究较一致，相对于SY、AY样品，MY混菌发酵样品中的酯类香气成分从种类到含量都有所增加，OAV进一步分析也明显可以看出，MY样品OAV＞1相对较多且数值较大，尤其是酯类成分，也进一步说明酯类成分是葡萄酒香气特征的主要贡献来源。

4 结论

综上所述，为探究啤酒酵母酿造葡萄酒的可行性，本研究从感官、理化、香气成分以及OAV分析等方面对啤酒酵母酿造葡萄酒的整体质量进行了分析。试验结果表明：啤酒酵母酿造的葡萄酒SY、MY样品基本理化指标符合相关国标，表明啤酒酵母S-189可以用于酿造风味独特葡萄酒，SY、MY葡萄酒感官综合评定均优于AY葡萄酒，且混菌发酵有助于提升葡萄酒风味，但其变化规律仍需进一步研究。本实验为啤酒酵母S-189混菌发酵酿造葡萄酒的研究提供了一定的科学依据。