盐酸小檗碱对恶性黑素瘤细胞A375增殖、凋亡和迁移的影响

郑增光 王鹏雁

恶性黑色素瘤是一种恶性程度极高的皮肤/黏膜恶性肿瘤，常起病隐匿，不易引起重视，确诊时多有淋巴结或远处转移，手术后放化疗不仅毒副作用大，且五年生存率仅16%[1-2]。小檗碱（berberine hydrochloride）是中药黄连的主要活性成分之一，具有抗菌消炎、抗病毒、降血糖血脂及抗抑郁等广泛的生物学作用[3-5]。体内、外实验表明，小檗碱具有较好的抗肿瘤作用[6-7]。本研究以TLR4 为靶点，观察盐酸小檗碱对黑色素瘤A375 细胞增殖、凋亡和迁移的影响，报道如下。

1 实验材料

1.1 细胞株 人黑素瘤A375 细胞株（上海中科院细胞库，批号SCCP-533）。

1.2 药 物 盐酸小檗碱（selleck 生物科技公司，批号S904601，分子量336.36），青霉素-链霉素溶液（美国Gibco 公司，批号15070063）。

1.3 试剂及仪器 CCK8 试剂盒（日本同仁生物公司，批号010417170406）；胎牛血清（美国Gibco 公司，批号10099141）、DMEM 细胞培养基（美国Gibco公司，批号1801040206）；Transwell 迁移室（德国Greiner 公司，批号DM-0079）；膜联蛋白V/碘化丙锭（Annexin.V/PI）凋亡检测试剂盒（美国BD 公司，批号6301518）；Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司，批号IK5013）、RNA 反转录试剂盒及PCR 实时荧光定量试剂盒（日本Takara 公司，批号15596026）；抗体TLR4（美国Cell signling 公司，批号14358）和βactin（美国Cell signling 公司，批号4970）；HRP 偶联的二抗（美国Cell signling 公司，批号CS1123）；流式细胞仪（美国BD 公司）；荧光定量PCR 仪（Thermo公司）；GBOXHR 型全自动图像分析仪（基因有限公司）。PCR 引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列：TLR4-F：5'-CAGAAGCTGGTGGCTGTG -3'；TLR4-R：5'-ATGTAGAACCCGCAAGTC-3'；β-actin-F：5'-AGCAGTTGTAGCTACCCGCCCA-3'；β-actin-R：5'-GGCGGGCACGTTGAAGGTCT-3'。

2 实验方法

2.1 细胞培养 将A375 细胞株选为研究对象，用含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL 青霉素和100μg/mL 链霉素的DMEM 培养基，在5%CO2，37℃恒温箱内培养，待细胞长至80%～90%时按1∶2～1∶4 的密度传代，每2～3 天传代1 次，取其对数生长期用于实验。其中空白对照组细胞仅接受10%胎牛血清的DMEM 培养基培养。而低、中、高剂量组细胞培养液中加入盐酸小檗碱，分别调整药物浓度为40、80、120μmol/L。……