高效液相色谱法及超高效液相色谱-质谱联用法在多种肾上腺皮质激素检测中的应用价值

吴凡，刘继华，陈祖芬

肾上腺皮质激素具有抗炎、抗过敏、抗休克及免疫抑制等多种药理作用，临床应用广泛。炎症细胞包括巨噬细胞、白细胞等，激素可通过抑制其吞噬作用、溶酶体酶的释放及炎症因子的合成、释放而减轻和防止组织产生炎症反应。皮质激素能对抗细菌内毒素对机体的刺激反应，减少细胞损伤，发挥抗毒、抗休克作用；此外，皮质激素还可防止或抑制细胞介导的免疫反应及延迟性的过敏反应，降低免疫球蛋白与细胞表面受体的结合能力，并抑制白介素的合成与释放，减轻原发免疫反应的扩展，从而起到免疫抑制作用。因此，部分药品为了增强药效，组分中添加一定量的肾上腺皮质激素，从而增强抗炎效果。其他行业如食品中常需检测激素残留量及肾上腺皮质激素［1-3］。本研究旨在探讨HPLC-PDA 法及UPLC-MS/MS 检测肾上腺皮质激素的效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 仪器：液相色谱仪：Waters 2695/PDA 检测器2996；液质联用仪：AcquityTM UPLC；Quattro Premier XE QQQ（Waters 公司）。试剂：HPLC：水为纯化水，乙腈、四氢呋喃为色谱纯；UPLC-MS/MS：水为娃哈哈纯净水，乙腈为农残级（Dikma 公司）；醋酸地塞米松、醋酸可的松、醋酸泼尼松龙、醋酸泼尼松、醋酸氢化可的松、醋酸曲安奈德、泼尼松龙、泼尼松、倍他米松、醋酸氟轻松、氢化可的松、丙酸倍氯米松、丙酸氯倍他索、曲安奈德、地塞米松、氯氟舒松、甲泼尼龙、曲安西龙、丁酸氢化可的松对照品均由中国药品生物制品检定所提供。

1.2 测定方法

1.2.1 HPLC-PDA 法

1.2.1.1 色谱条件 柱：Waters Sunfire（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 ml/min；流动相：梯度洗脱，见表1：柱温：30 ℃；进样量：5 μl，检测波长240 nm。

表1 HPLC-PDA 法的梯度洗脱

1.2.1.2 测定方法 取上述19 种对照品，加甲醇制成约0.5 μg/ml 的溶液，作为混合对照品溶液。精密量取5 μl 注入液相色谱仪，记录色谱图。各组分中除泼尼松龙、氢化可的松未完全分离外（分离度1.3），其余均能达到完全分离。各物质的分离图谱及紫外光谱图见图1。

图1 HPLC-PDA 法色谱图

1.2.2 UPLC-MS/MS 法

1.2.2.1 色谱及质谱条件 色谱方法：流动相：为程序洗脱，见表2；流速：0.4 ml/min；柱温：30 ℃；C18 柱：Waters Xterra MS C18 150 mm×2.1 mm，5 μm。质谱方法：电喷雾接口，正离子检测模式，毛细管电压：3.00 KV，锥孔电压：35.00 V，源温：105 ℃，脱溶剂温度：350 ℃，脱溶剂气N2：400 L/h；锥孔气：50 L/h。

表2 UPLC-MS/MS 法的程序洗脱

1.2.2.2 测定方法 取曲安西龙、泼尼松、甲泼尼龙（泼尼松龙、氢化可的松）、倍他米松（地塞米松）、曲安奈德、醋酸泼尼松龙、醋酸氢化可的松、醋酸泼尼松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、醋酸曲安奈德、醋酸氟轻松、氯氟舒松、丙酸氯倍他索及丙酸倍氯米松18 种对照品，分别加入甲醇制成约0.05 μg/ml 的溶液，做二级质谱找到各物质的分子离子峰和碎片峰，用质谱检测器中可用多级反应模式（MRM）进行检测，见表3；再将18 种对照品用甲醇制成约0.05 μg/ml 的混合溶液作为混合对照品溶液。精密量取3 μl 注入液相质谱仪，记录质谱图。

表3 18 种对照品的母离子与子离子情况

2 结果

由于丁酸氢化可的松的质谱响应较低，故未检测；18 种物质中除丙酸倍氯米松为ESI+外其余均为ESI-；醋酸地塞米松和曲安奈德虽母离子相同，但子离子不同，且保留性能不同，可以进行区分；泼尼松龙、氢化可的松与甲泼尼龙重合，地塞米松与倍他米松重合，但因各自的母离子和子离子均不相同，在质谱检测器中可用多级反应模式（MRM）进行分别检测，不会造成干扰，见图2。

图2 UPLC-MS/MS 法分离图谱

3 讨论

HPLC 法分离性能好、灵敏度高且操作快速简便，是临床常用的检测方法之一，本研究首先采用HPLC 法快速筛选19 种肾上腺皮质激素。由于不同肾上腺皮质激素的结构、紫外光谱图均类似，最大吸收波长在239～244 nm 范围内，故本研究选择240 nm 波长进行测定，可兼顾所测定的19 种物质。

超高效液相色谱（UPLC）是基于传统的HPLC 技术上发展起来的，但UPLC 的检测效率及灵敏度均较高，分离能力较强［4］。UPLC-MS/MS 也因质谱特有的检测方式而不同于HPLC-PDA，液质联用的特点是离子碎片特征性强，提供的信息丰富。质谱串联检测器可采用二级子离子做定量离子，利用MRM 进行准确的定性、定量，可极大提高检测灵敏度。利用其MS 的特征离子峰，地塞米松的母离子/子离子为437/361，倍他米松为391/361，甲泼尼龙为373/343，泼尼松龙为359/329，氢化可的松为361/331，故当地塞米松与倍他米松、甲泼尼龙与泼尼松龙及氢化可的松在紫外图（或总离子流图）相重合时，利用质谱检测器能提取出单个物质的质谱图进行积分，且不受其他物质的干扰。

在日常生活中，常采用化学、薄层、紫外和HPLC 法进行鉴别伪劣产品，本研究通过HPLC-PDA 法确定色谱的保留时间及紫外光谱中最大吸收峰位置是否一致，可初步判断是否存在19 种肾上腺皮质激素中的物质，但是保留时间与紫外光吸收图谱只能从一方面认为可能是同一物质，只有通过不同类型的方法才能真正确定而不会误判，所以本研究最终采用UPLC-MS/MS 法进行确证。质谱检测器是检测物质的质荷比的，与紫外检测器是完全不同的方法。通过两种方法均确定为同一物质的时候才能下结论。

本研究采用HPLC-PDA 法及UPLC-MS/MS 法测定19 种肾上腺皮质激素，可鉴定药物制剂、中药及体液中的多种皮质激素，且不受基质及赋形剂等的干扰，可使检测结果更准确、可靠，可广泛用于对中药、保健品或化妆品添加西药成分、食品中残留激素及体育中使用违禁药品等的检测。