Sirt3 基因RNA 干扰慢病毒载体及稳定表达的人神经母细胞瘤SH-SY5Y 细胞株的构建

张静怡邓永宁张 萌屈秋民∗

(1.河南省人民医院老年医学科,郑州大学人民医院,郑州 450003;2.西安交通大学第一医院神经内科,西安 710061)

随着全球人口老龄化,衰老问题日益突出,寻找衰老相关疾病的治疗靶点成为研究的热点。Sirtuin 家族是一种线粒体NAD 依赖的去乙酰化酶,越来越多的研究发现Sirtuin 家族七个成员(Sirt1-Sirt7)与衰老相关疾病密切相关[1-2]。Sirt3 主要位于线粒体内,研究发现它通过改善线粒体功能、减轻氧化应激、增加三磷酸腺苷(ATP)生成、抑制凋亡等机制,在衰老相关的神经退行性疾病中发挥神经保护作用[3-5]。 帕金森病作为第二大神经退行性疾病,严重影响了患者的生活质量并且威胁着患者的生命,给社会增加了沉重的经济负担。 帕金森病的发病机制包括线粒体功能障碍、氧化应激等[6],所以Sirt3 在其中的作用研究受到关注。 本实验利用基因干扰RNAi(RNA interference)技术,拟构建含有RNAi 片段的慢病毒载体,抑制人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y 细胞中Sirt3 基因的表达。 人神经母细胞瘤SH-SY5Y 细胞具有多巴胺能神经元的特性,是帕金森病体外细胞模型中常用的细胞。 实验拟构建稳定沉默Sirt3 基因表达的细胞株,为后续研究Sirt3 在帕金森病细胞模型中的作用提供基础。

1 材料和方法

1.1 实验细胞

人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)购买于美国ATCC;293T 细胞购自中科院上海细胞生物学研究所。

1.2 主要试剂与仪器

GV248 载体、pHelper 1.0 载体,pHelper 2.0 载体购自上海吉凯基因技术有限公司;PCR 用试剂primer(R&F)、dsDNA oligo 均购自上海吉凯基因技术有限公司;质粒提取试剂盒购自QIAGEN 公司;Lipofectamine 2000 购自……