周围神经损伤病理进程中巨噬细胞作用研究进展

雪若妍 杨华

中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院耳鼻咽喉头颈外科（北京 100730）

华勒氏变性（Wallerian degeneration）是周围神经（peripheral nerve,PN）受到损伤或发生炎症后，轴突出现崩解、碎裂的过程,同时也是周围神经损伤后近端轴突再生的必要条件。华勒氏变性过程中，先天性免疫细胞（中性粒细胞，巨噬细胞和树突细胞）和获得性免疫细胞（T细胞和B细胞）均在病理部位聚集，并引起雪旺氏细胞去分化（de-differentiation）和轴突再生。目前认为，PN损伤后巨噬细胞发挥非常重要的作用[1]。

面神经（facial nerve,FN）虽然是颅神经仍然属于PN，FN损伤后的修复研究多借鉴坐骨神经和臂丛神经损伤。目前，FN损伤中巨噬细胞发挥作用的报道较少。本文初步总结和分析PN损伤后，巨噬细胞所发挥作用的报道，为研究FN损伤的修复提供参考。

1 巨噬细胞的两种存在形式：固有巨噬细胞和浸润巨噬细胞

目前认为周围神经系统存在两种巨噬细胞。一种是起源于卵黄囊和胚胎肝组织，称为组织固有巨噬细胞（tissue-resident macrophage），终生静息存留在健康组织内，在组织发生病损时发挥作用。另一种是浸润巨噬细胞（infiltrating macrophage），来源于骨髓，在组织病变时浸入组织。中枢神经系统的固有巨噬细胞被称为小胶质细胞，来源于卵黄囊。但是，肠道的固有巨噬细胞起源于骨髓[2]，周围神经的固有巨噬细胞部分来源于骨髓。在坐骨神经中，固有巨噬细胞约占细胞总数6%；在人类感觉和交感神经节中固有巨噬细胞比例为20%[2]。浸润型巨噬细胞来源于骨髓的单核细胞，组织损伤或感染以后进入组织。坐骨神经切断后，浸润和固有型巨噬细胞的比例为3：1[2]。

在PN损伤或感染后，固有和浸润的巨噬细胞具有不同的功能。Mueller等观察到在坐骨神经挤压后两天内，固有巨噬细胞开始吞噬髓鞘；雪旺氏细胞因此去分化，这在浸润巨噬细胞流入之前发生。他们还在这个早期时间点观察到了固有巨噬细胞的增殖。目前认为，虽然固有巨噬细胞、中性粒细胞和雪旺氏细胞是神经损伤后的第一应答者，但是，巨噬细胞和去分化的雪旺氏细胞可以释放大量的促神经轴突再生因子[3]。

2 巨噬细胞极化（两种功能状态）

巨噬细胞被分为两种表型：促炎性巨噬细胞（M1）和抗炎巨噬细胞（M2）。M1和M2巨噬细胞分别代表巨噬细胞活化的两种极端状态。M1巨噬细胞介导宿主防御并分泌促炎细胞因子和分子以引起组织损伤和疾病发展，而M2巨噬细胞表达高水平的抗炎分子以减少炎症并促进疾病恢复。从静息状态到M1状态的巨噬细胞的活化通常由微生物产物和促炎细胞因子和分子诱导，如图1[4,5]、表1[6]。

图1 A巨噬细胞表型转化以及功能示意图。巨噬细胞经脂多糖和干扰素γ可极化为M1表型，经IL-4和IL-13转化为M2表型。这两个亚型之间可相互转化。M1巨噬细胞表达一氧化氮合酶（iNOS），分泌肿瘤坏死因子α、白细胞介素-6、活性氧（ROS）、白细胞介素-1β、一氧化氮和基质金属蛋白酶（MMPs）。M2巨噬细胞表达精氨酸酶，分泌IL-10、转化生长因子-β和细胞外基质分子（ECM）。B M1(粉红色)和M2(蓝色)样巨噬细胞在轴突切断的神经元胞体和远端神经节上的确切功能尚无定论。Fig.1 A.Diagram showing the polarization of macrophages in vitro by LPS and IFN-γ to an M1-like phenotype and by IL-4 and IL-13 to an M2-like phenotype.The color spectrum between the two subtypes indicates the spectrum of macrophage phenotypes that are thought to exist in vivo.M1 macrophages express nitric oxide synthase(iNOS)and secrete TNFα,IL-6,reactive oxygen species(ROS),IL-1β,NO(nitric oxide),and matrix metalloproteinases(MMPs).M2 macrophages express arginase and secrete IL-10,TGF-β,and extracellular matrix molecules(ECM).B.Questions remain as to the exact function of M1(pink)-and M2(blue)-like macrophages on the axotomized neuronal cell bodies and the distal nerve segment.

表1 巨噬细胞极化为M1（促进炎症反应）和M2（抗炎症反应）期的表型Table 1 Macrophages polarize into M1(proinflammatory)and M2(anti-inflammatory)phenotypes

3 周围神经损伤后，巨噬细胞在损伤远端、近端以及神经节周围聚集

目前，对轴突切断后周围神经中巨噬细胞的研究几乎完全集中在神经损伤远端[4]（图2）。坐骨神经损伤后3天，巨噬细胞在损伤远端聚集，14天达到峰值，56天仍未完全消失。损伤后3天，巨噬细胞在神经外膜的聚集多于内膜，而在14天正好相反[7]。但是，这些聚集的巨噬细胞的清除方式尚无明确定论。已有文献报道认为是由于巨噬细胞的调亡，或是淋巴结和脾脏的淋巴细胞清除发挥了作用[8]。另外，在损伤的坐骨神经近端，巨噬细胞亦有少量的聚集。

图2 周围神经轴突切断或挤压后神经元的示意图。图中显示了巨噬细胞聚集的两个部位。图的下部显示了远端轴突的变性，雪旺氏细胞的转分化并分泌趋化因子CCL2，吸引巨噬细胞至远端变性段。这是轴突切断后巨噬细胞聚集的经典观点。图的上部显示巨噬细胞也聚集在切断轴突的神经元胞体周围，这些神经元本身在切断轴突后分泌趋化因子CCL2。Fig.2 A diagram of a hypothetical peripheral neuron following axonal transection or crush showing the two sites of macrophage accumulation.The lower part of the figure shows the degeneration of the distal axonal segment,the trans-differentiation of Schwann cells,the secretion by the Schwann cells of the chemokine CCL2,and the attraction of macrophages to the distal degenerating segment.This is the classical view of macrophage accumulation after axotomy.The upper part of the figure shows that macrophages also accumulate around the axotomized neuronal cell body and these neurons themselves secrete the chemokine CCL2 following axotomy.

轴突切断后巨噬细胞聚集的另一位点为神经元胞体（图2）。坐骨神经切断后，巨噬细胞聚集在腰椎背根神经节（dorsal root ganglion，DRG），损伤后4天出现，32天时还可以见到。巨噬细胞也在颈上神经节（superior cervical ganglion，SCG）聚集，损伤后的2天出现，8-14天保持峰值[9]。

FN的神经元胞体位于脑干，该神经损伤后，小胶质细胞（中枢神经系统中的巨噬细胞）将聚集在损伤神经胞体周围[10,11]。

4 巨噬细胞的趋化因子

趋化因子（或趋化细胞因子）是将白细胞吸引至损伤或感染组织的小肽分子。趋化因子作用于白细胞表面的G蛋白偶联受体。CCL2是单核细胞的主要趋化因子，并且其与受体CCR2的亲和力最高。CCR2由单核细胞和巨噬细胞表达；然而，它同时也在损伤后的感觉神经元与卫星胶质细胞中表达。在Ccl2-/-或Ccr2-/-动物中，神经损伤后远端坐骨神经和DRG中发生巨噬细胞积聚减少[12]。若注射抗体，消耗CCL2后，可抑制远端坐骨神经中的巨噬细胞积聚并抑制髓鞘的清除。Lindborg等通过注射CCR2的抗体（即MC-21）发现相同的结论，证实CCL2与CCR2结合后趋化巨噬细胞[12]。

在轴突切断术后Ccl2 mRNA在损伤远端12小时内表达，并在1-3天之间达到峰值[13]。

但是，在大多数研究中，在假手术大鼠或小鼠脊髓背根神经节中检测到非常低量的Ccl2 mRNA和蛋白质[14]。目前还不清楚如何解释正常神经节表达Ccl2 mRNA和蛋白质的意义。

5 巨噬细胞在华勒氏变性中的作用

华勒氏变性是周围神经损伤后近端轴突再生的必然和必要过程，没有适当的华勒氏变性就不可能有满意的轴突再生。华勒氏变性包括远端轴突变性、髓鞘分解、神经胶质细胞增殖、血-神经屏障（BNB）损害以及巨噬细胞的浸润和活化[15]。在坐骨神经损伤后早期，浸润巨噬细胞流入之前，固有巨噬细胞增加并激活，处于增殖状态并参与华勒氏变性。固有巨噬细胞能够通过Toll样受体（TLRs）的表达和产生IL-13和IL-1β诱导炎症过程[16]。这些变化在坐骨神经损伤后第3天和第4天更明显，并且在坐骨神经损伤后28天仍可识别ED1阳性的固有巨噬细胞[2]。更重要的是，这些固有巨噬细胞参与了坐骨神经损伤后的早期髓鞘吞噬作用[2]。

在华勒氏变性后期，巨噬细胞是导致去除髓鞘和轴突碎片的关键细胞。已经证明，在华勒氏变性过程中，可以看到浸润巨噬细胞中含有髓鞘来源的脂类分子[17]。在小鼠周围神经损伤后，用二氧化硅阻断单核细胞后，可导致巨噬细胞浸润的减少以及髓鞘降解速度的减慢。进一步的研究表明，使用不同的药理学和遗传学方法，在巨噬细胞耗尽的动物中华勒氏变性的发生变延迟[17]。活细胞成像研究还表明巨噬细胞在轴突断裂之前很久就到达损伤部位[18]。总之，这些发现支持巨噬细胞在华勒氏变性中起关键作用。

6 巨噬细胞在周围神经再生过程中的作用

虽然巨噬细胞最初因其有效的吞噬活性而受到重视，但越来越多的研究证明巨噬细胞在周围神经再生中也发挥着关键作用。Barrette等[17]发现通过抑制巨噬细胞，如向坐骨神经损伤局部连续递送更昔洛韦或在CD11b-TKmt-30小鼠中全身给予更昔洛韦后，会损害轴突再生和运动功能的恢复。表明靶向诱导巨噬细胞、促进周围神经损伤修复和功能恢复的潜在可能性。

巨噬细胞产生多种因子，如蛋白酶和生长促进因子/细胞因子，以及刺激细胞外基质(extracellular matrix,ECM)重塑以促进周围神经再生。雪旺氏细胞通过不同的机制在周围神经再生中发挥着重要作用[19]，值得注意的是通过调节受损神经中雪旺氏细胞的活性可以对巨噬细胞的功能进行调节，包括有丝分裂和去分化，以及渗透和/或迁移[20]。更重要的是，巨噬细胞也影响雪旺氏细胞的功能。坐骨神经切断后，损伤部位的缺氧状态被巨噬细胞特异性地感知后，巨噬细胞可分泌VEGF-A诱导血管分化，帮助雪旺氏细胞迁移并跨越断端（桥接作用），诱导神经再生[21]。除了损伤后进入远端神经外，巨噬细胞也在轴突切断的细胞体周围积聚，在那里它们直接刺激神经再生[22]。

7 面神经损伤的研究意义

面部表情在社会交往行为中发挥重要作用。FN损伤可导致面部活动不对称、表情缺失、口干、眼干等，严重影响人类的社会生存能力[23]。新生儿FN损伤的发生率为0.6-1.8/1000，通常与产伤有关。成人FN损伤的发生率为每10万人口17-35例[24]。成人FN损伤病因主要包括：特发性疾病（贝尔麻痹）、感染性疾病（Hunt综合征、中耳炎、胆脂瘤等）、颞骨损伤。因此，进一步深入研究FN损伤后保护与再生机制具有重要的临床意义。

85%的FN损伤患者在损伤后的3-4周内可不完全恢复，损伤后的6个月内可以完全恢复。93-98%的不完全损伤可以获得完全恢复。在完全损伤中：年龄大于60岁、损伤3周后几乎没有恢复、妊娠过程中的损伤、神经电生理（损伤3天之后，3周之内检查）显示神经退变、合并糖尿病等系统疾病患者的预后较差[25]。目前在临床上，FN损伤的治疗可分为非手术方法以及手术方法两大类。前者虽缺乏真正的神经肌肉修复，但仍是改善面部静态外观的重要辅助手段。手术方式主要包括FN吻合、FN减压及自体神经移植等[26]。由于其周围神经受到局部和整体的影响，FN损伤后再生困难。虽然目前外科手术取得显著进步，但由于自体神经移植的本质上是用自身的正常神经修复损伤神经，存在供体不足的局限性，同时还会造成供区功能的丧失。因此，FN损伤的治疗仍然是耳鼻喉科的临床难题。

大部分不完全性周围神经损伤可以治愈，但是完全性周围神经损伤后的修复仍然是临床难题。由于周围神经损伤在肢体和椎旁部位更加常见，因此对于周围神经感觉和运动损伤的研究多使用颈椎脊髓的背根神经节以及坐骨神经的动物模型，尤其是小鼠动物模型。

FN属于周围神经，损伤后严重影响患者的生存质量，是耳鼻喉科的临床难题。无论是机械性，还是特发性疾病、感染性疾病所致的FN损伤，华勒氏变性是神经损伤和修复的必经之路，巨噬细胞在华勒氏变性中起到了显著的作用。周围神经损伤后，固有巨噬细胞、中性粒细胞和雪旺氏细胞是神经损伤后的第一时间反应者。继而巨噬细胞发生极化，通过控制IL-4、IL-10、IL-13、CCL2、蛋白酶和生长促进因子等细胞因子，刺激ECM等多种方式参与华勒氏变性和轴突再生过程。因此，进一步研究了解巨噬细胞在PN损伤中发挥的重要作用，对治疗FN损伤具有非常重要的理论参考价值。