胰腺癌组织中TRPC6、B7-H1蛋白表达与肿瘤发生发展的关系

张福昌 张洪彦 焦宇柯

胰腺癌是临床最为常见的腹部恶性肿瘤之一，恶性程度高，多数患者就诊时已处于病变晚期，失去了手术治疗机会，因此患者预后较差。近年来人们一直在寻找一种和肿瘤发生、发展、转移的相关因子，可以预测肿瘤发生、发展、转移和预后。B7家族一直是临床研究的热点肿瘤标志物，协同刺激因子B7家族包括了多种受体。B7免疫球蛋白超家族成员-1主要表达在淋巴细胞等免疫细胞表面，在多种实体肿瘤细胞中存在高表达；瞬时受体则是钙离子通道，和神经系统干细胞增殖与分化密切相关，通过激活会促进胚胎神经干细胞分离增殖，瞬时受体电位阳离子通道6表达则同多种恶性肿瘤发生、发展存在密切关系[1]。本研究分析了胰腺癌组织中瞬时受体电位阳离子通道6(TRPC6)、B7免疫球蛋白超家族成员-1(B7-H1)蛋白表达与胰腺癌发生发展的关联，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取我院收集的手术后胰腺癌病理标本112例及其对应的癌旁组织标本，收集时间2015年3月至2020年1月。纳入标准：①胰腺癌患者的诊断标准参考胰腺癌综合诊治中国专家共识(2014年版)中的标准；②所有标本均来源于手术切除后标本，经病理学检查证实；③患者年龄19～75岁；④所有患者手术前无放化疗病史；⑤本研究符合相关医学伦理学规定。排除标准：①胰腺良性肿瘤组织；②病理学资料缺失；③合并其他部位肿瘤接受放化疗、免疫治疗的患者。 选取的112例胰腺癌患者，年龄51～75岁，平均(62.2±6.6)岁；男性59例、女性53例；TNM分期：Ⅰ期37例、Ⅱ期54例、Ⅲ期21例；病理学检测淋巴结转移阳性的患者有18例、未发现淋巴结转移的患者有94例；病灶最大直径≥3.0 cm 52例、<3.0 cm 60例。

1.2 Western-blot技术

剪取50 mg胰腺肿瘤组织、癌旁组织，在液氮下碾磨成粉末状，转移至1.5 ml离心管加入配制好预冷组织裂解液约1.5 ml，冰上静置30 min，高速离心机以12 000 r/min离心25 min，吸取上清液为组织总蛋白，按蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度。按照操作流程采取配胶、电泳、转膜、封闭、杂交、洗涤过程操作，将膜用去离子水漂洗，滤纸贴角吸干，滴加混合液在膜上，3 min后用滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定在片盒中，在暗室内迅速盖上胶片关闭胶盒，曝光5～20 min取出胶片立即完全浸入显影液中1～2 min，清水漂洗后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干。使用底片扫描仪扫描胶片，通过凝胶成像仪读取目的电泳条带和内参的密度扫描值，计算相对表达量RI值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 2组患者的TRPC6蛋白、B7-H1蛋白表达强度比较

胰腺癌癌组织中的TRPC6蛋白、B7-H1蛋白表达强度均高于癌旁组织，差异具有统计学意义(P<0.05)；见表1、图1。

表1 2组患者的TRPC6蛋白、B7-H1蛋白相对表达强度比较

注：1为胰腺癌癌组织，2为癌旁组织。

2.2 胰腺癌组织的TRPC6蛋白、B7-H1蛋白表达强度与患者临床病理学特征的关系

在淋巴结阳性转移的胰腺癌患者的TRPC6蛋白、B7-H1蛋白表达强度均高于淋巴结阴性胰腺癌患者(P<0.05)；在不同TNM分期的胰腺癌组织中，Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期胰腺癌组织中的TRPC6蛋白表达强度呈逐渐增强的趋势，组间差异均具有统计学意义(P<0.05)；在TNMⅢ期胰腺癌组织中的B7-H1蛋白表达强度高于Ⅰ期、Ⅱ期患者，差异具有统计学意义(P<0.05)；见表2。

3 讨论

胰腺癌是临床恶性程度较大的肿瘤，预后较差，且发病率呈现升高趋势。虽然随着医学的进步恶性肿瘤患者的生存时间得以延长，生活质量得到改善，但是晚期胰腺癌患者的生活质量仍较差，主要是晚期肿瘤导致癌性疼痛对患者生理和心理上干扰较大[2]。随着分子生物学的快速发展和基因技术的研究寻找肿瘤治疗靶点实行分子靶向治疗已成为肿瘤治疗新途径，研究发现肿瘤发生、发展和转移属于多步骤、多环节的复杂过程，这一过程中肿瘤细胞周围免疫微环境起到了不同程度促进或者抑制效果，T细胞介导免疫反应起到了重要作用，尤其是第二信号在免疫应答中发挥传递正性信号或者负性信号协同效果，决定了T细胞应答是初始、增强、维持还是抑制、弱化或者转变为无反应，这些传递信号的因子又称为协同刺激因子[3-4]。

本研究分析胰腺癌组织中瞬时受体电位阳离子通道6(TRPC6)、B7免疫球蛋白超家族成员-1(B7-H1)蛋白表达与胰腺癌发生发展的关系。钙离子具有维持人体内环境稳态作用，细胞内钙离子升高一般是通过细胞外钙离子内流和细胞内内质网钙库释放形成，细胞各种调控细胞则精密控制细胞钙的内流与释放。瞬时受体属于钙离子通道的一种，广泛分布在生物、组织器官与细胞系中，该通道有6个跨膜多肽，可以装配成四聚体，在细胞膜上构成离子通道，瞬时受体电位阳离子通道是最早被报道的瞬时受体点位超级组亚族，TRPC6定位在细胞内流动囊泡中，一旦细胞受到刺激就会流动到细胞质膜发挥作用[5-6]。研究发现TRPC6过度表达可以加速细胞周期中G2期和M期之间过渡，从覆盖G2期DNA损伤检验点，会导致细胞发生集聚形成突变，发展为恶性程度更高的细胞，这些DNA检查点一旦被破坏就会造成细胞进入分离器引发基因组不稳定，导致基因突变累积，形成恶性肿瘤细胞[7]。此外TRPC6还同血管生成关系密切，可以调节血管内皮生长因子诱导细胞内钙离子浓度升高，通过TRPC6钙离子内流提升血管通透程度[8]。B7超家族是目前临床已知协同刺激信号因子之一，TB7家族已经证实是唯一可以从抗原递呈细胞单向传递信号到T细胞协同刺激因子，对于激活或者抑制T细胞免疫应答反应至关重要[9]。B7-H1属于B7家族新发现成员之一，在负性调节人体免疫反应中具有重要作用，可以优先刺激T淋巴细胞分泌大量的白细胞介素，抑制T细胞活化和增殖过程，生理状态下正常组织能够表达B7-H1下调T细胞功能，组织自身反应性T细胞形成，避免了T细胞对组织过度的反应形成自身免疫性疾病[10]。研究显示，肿瘤细胞可以表达和分泌膜分子和可溶性细胞因子形成肿瘤细胞生长微环境，干扰和阻止机体免疫系统对肿瘤细胞增殖的监控，肿瘤细胞可以诱导性表达B7-H1造成肿瘤抗原特效T细胞凋亡，逃避人体免疫监视系统继续增殖，因此造成肿瘤浸润转移能力的增强，同肿瘤患者预后具有密不可分的关系[11]。

表2 胰腺癌组织的TRPC6、B7-H1蛋白相对表达强度与患者临床病理学特征的关系

本研究发现，癌组织中的TRPC6蛋白、B7-H1蛋白表达强度均高于胰腺癌癌旁组织，TRPC6蛋白、B7-H1蛋白在胰腺癌组织中呈现高表达状态。淋巴结阳性转移的胰腺癌患者的TRPC6蛋白、B7-H1蛋白表达强度均高于淋巴结阴性胰腺癌患者；Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期胰腺癌组织中的TRPC6蛋白表达强度呈逐渐增强的趋势；而TNMⅢ期胰腺癌组织中的B7-H1蛋白表达强度高于Ⅰ期、Ⅱ期患者，提示了TRPC6蛋白、B7-H1蛋白表达强度同患者淋巴结转移和肿瘤分期之间具有一定关联。本研究优势在于利用免疫组化法对TRPC6蛋白、B7-H1蛋白在胰腺癌中的表达进行了测定，这和以往研究结果相似，同时还发现两者表达与患者淋巴结转移以及肿瘤分期之间关系密切，这在以往报道中较为少见。但是本研究样本量少，缺乏丰富的患者临床资料及预后资料，而且对于具体参与肿瘤发生发展的机制目前尚未明确，还需要扩大样本量，收集患者的详细资料以及临床特征深入分析，为以后胰腺癌基因和免疫治疗提供新的方向。

综上所述，胰腺癌组织中TRPC6蛋白、B7-H1蛋白表达强度均显著高于癌旁组织，并且与胰腺癌的发生及发展有一定的关系。