基于SSR分子标记的油梨种质遗传多样性分析

周海兰，李绍鹏，李茂富，庞新华，周俊岸，欧景莉，李菊馨，单 彬，唐桓伟，李季东

(1 广西壮族自治区亚热带作物研究所，南宁，530001；2 海南大学热带农林学院，海口，570228)

油梨PerseaamericanaMill，原产于热带美洲，为樟科(Lauraceae)鳄梨属乔木果树，是最具经济价值的亚热带热带水果之一，已在全球广泛商业种植，生产发展迅速，产量与消费量剧增。油梨是一个高多样性的物种，其遗传变异产生了不同品系[1]，分别为墨西哥种系(P.americanaMiller var.Drymifolia)、危地马拉种系(P.americanaMiller var.Guatemalensis)和西印度种系(P.americanaMiller var.Americana)。西印度油梨原产于墨西哥南部和中美洲的热带低地地区，而危地马拉和墨西哥油梨原产于各自国家的中高海拔地区，每个种系都有重要的经济性状，如危地马拉品种的种子小，果实成熟晚，中等耐寒；墨西哥品种早熟和耐寒，含油量高；西印度品种果实大，含油量低，耐盐碱，但耐寒性最弱[2]。此外还有杂交种系，一般以炼油为主，代表品种有博思7(Booth 7)、博思8(Booth 8)、福尔特(Fuerte)等。油梨是集健康、营养、保健于一体的名贵水果，含有丰富的蛋白质(1%～3%)，大量脂溶性维生素(维生素A、B、D、E等)，叶酸，大量的钙、钾、镁、钠、磷、硫、硅[3-5]，深受消费者喜爱，我国栽培范围和面积正逐年扩大，具有巨大的发展潜力。

油梨属异型杂交植物，研究油梨品种多样性，对油梨的深入开发有重要意义。国外，分子标记已被证明在阐明油梨种质的遗传关系方面非常有用，Lavi等[6]应用4个DNA指纹探针(DFP)对油梨进行品种鉴定、特性描述及遗传图谱分析；Mhameed等[7]尝试利用小卫星DNA标记对24份油梨栽培种进行归类、评估和分析；Furnier等[8]对叶绿体DNA、核糖体DNA和编码纤维素酶的基因进行了限制性片段长度多态性(RFLP)分析研究来推断油梨的系统发育。此外，还有RFLP[9]、RAPD[10]、SSR[11-14]、ISSR[15]、AFLP[16-17]、SNP[18]已经应用于油梨品种鉴定和分类、种质资源评价、遗传多样性等研究。油梨种质的遗传图谱也已经利用分子标记进行构建[19-21]。国内，RAPD、SSR已分别用于油梨品种分类[22]、授粉研究[23]及引物开发[24]。国内关于油梨分子标记研究相对滞后，在一定程度上限制了油梨遗传改良和育种工作的进行。本研究对油梨种质资源圃内收集的海南、广西、云南等省(区)的54份油梨种质资源进行SSR分子标记分析，有利于科学评价这些种质资源的遗传多样性和亲缘关系，对于优化油梨种质资源圃、油梨杂交育种亲本选择有重要应用价值，可以很大程度地降低种质资源保存的重复性，提高育种效率。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料是从广西、云南、海南等地区收集到的54份油梨种质(见表1)，所有材料均取自海南大学园艺园林学院油梨种质资源圃。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。Taq酶、dNTPs均购自TAKARA公司。PCR仪为Eppendorf Mastercycler Pro S，琼脂糖凝胶电泳仪为Biometro Standard Power Pack P25，核酸蛋白仪为Nanovue plus超微量分光光度计，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳仪为北京六一仪器厂生产的DYY-10C型。

表1 供试油梨种质

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取与检测 选取供试种质的健康干净嫩叶，采用改良2×CTAB法[25]提取油梨DNA，并用核酸蛋白仪检测DNA浓度和纯度，DNA原液放置-20 ℃保存备用。

1.2.2 SSR-PCR扩增 试验选用Sharon等[19]和Ashworth等[26]的SSR引物序列，从中筛选出稳定性高、重复性好、有多态性产物的引物23对(见表2)，对油梨种质DNA进行PCR扩增。SSR-PCR扩增的反应程序和反应体系参考文献[25]进行。利用6%变性聚丙烯酰胺凝胶进行PCR产物分离，在60 W恒定功率下电泳1.5～2 h，银染检测参考杨珺[27]的银染法进行。

表2 用于油梨SSR分析的23对引物序列

1.3 数据统计分析

观察电泳图，统计扩增条带时，按同一位置有无条带进行1、0赋值，有带(阳性)记为1，无带(阴性)记为0，形成(1、0)数据矩阵。采用Popgene 1.32计算遗传多样性参数，利用NTSYSpc 2.1软件对统计数据进行遗传相似系数计算和UPGMA法聚类，分析54份油梨种质的亲缘关系和遗传多样性，并根据遗传相似系数进行主成分分析(PCA)。

2 结果与分析

2.1 遗传多样性分析

试验结果看出，23对引物扩增产生多态位点在2～10个之间，共产生多态性位点119个，平均每对引物扩增多态位点数5.17个；23对SSR引物的多态性位点百分比(PPL)均达到100%，多态性信息量(PIC)为0.04～0.39，其均值为0.33；有效等位基因数(Ne)的分布范围为1.120 8～1.668 9，其平均值为1.321 9；Nei’s基因多样性指数(H)变异范围为0.091 5～0.375 6，其平均值为0.205 9；Shannon’s信息指数(I)变化在0.171 3～0.553 7之间，其平均值为0.335 6(见表3和图1)。说明试验选用的23对SSR多态性引物对油梨种质资源有较高的多态性检测能力，适用于油梨种质资源的鉴别及亲缘关系分析。

注：1—54表示油梨种质Hass、大岭7号、Fuerte、Bacon、DKM、Pollock、大岭2号、大岭3号、大岭4号、大岭5号、大岭8号、大岭10～15号、大岭17号、芙蓉田1～9号、桂肯大2号、桂肯大3号、热研2号、热研3号、热研16号、热研17号、YN003、YN005、YN006、YN010、YN011、YN016、YN020、YN022、YN027、YN028、大岭6号、大岭9号、大岭16号、Y1-10、Y2-12、Y3-1、Y3-23、Y6-5、Y7-20、Y10-1。图2和图3同。图1 引物AVD013对54份油梨种质的扩增结果

2.2 聚类分析结果

根据54份油梨种质材料间的遗传相似系数，按UPGMA法进行聚类分析，得到聚类图。54份油梨种质的遗传相似系数为0.59～0.97，在遗传相似系数为0.71时，可划分为4大类群：Fuerte单独归为第Ⅰ类，收集自广西，该种质属杂交种系，在成熟叶片上较为特殊，叶面状态为平展，其他品种均为凹陷，叶柄长度也最长，占叶片长度的1/3以上，明显区别于其他种质，同时，与其他种质间的遗传相似系数最小，为0.59，说明在种质间存在最大的遗传差异。Hass、Bacon聚为第Ⅱ类，收集自广西。聚为第Ⅲ类的种质有4份，即Y1-10、Y3-1、Y6-5、Y10-1，都来自海南。余下的47份种质聚为第Ⅳ类，占供试材料的87.04%。第Ⅳ类遗传相似系数在0.77水平上又可分为5个亚类，第Ⅳ-1亚类包括大岭11号、芙蓉田2号；第Ⅳ-2亚类包括大岭4号、桂肯大3号、Y7-20，第Ⅳ-3亚类包括Y2-12，第Ⅳ-4亚类包括热研3号，第Ⅳ-5亚类包括大岭7号、DKM、Pollock、大岭2号、大岭3号、大岭5号、大岭8号、大岭10号、大岭12号、大岭13号、大岭14号、大岭15号、大岭17号、芙蓉田1号、芙蓉田3号、芙蓉田4号、芙蓉田5号、芙蓉田6号、芙蓉田7号、芙蓉田8号、芙蓉田9号、桂研10号、桂肯大2号、热研2号、热研16号、热研17号、YN003、YN005、YN006、YN010、YN011、YN016、YN020、YN022、YN027、YN028、大岭6号、大岭9号、大岭16号、Y3-23(见图2)。

表3 54份油梨种质SSR标记遗传多样性参数

图2 54份油梨种质聚类分析

2.3 主成分分析

为更好反应种质间的亲缘关系，基于遗传相似系数矩阵进行主成分分析，各种质形成的二维散点平面分布。前3个解释总遗传变异的主成分贡献率依次为10.54%、7.52%和7.01%，占总遗传变异的25.07%。在二维散点平面分布图中，位置越近，表示亲缘关系越近，反之则越远。将位置靠近的油梨种质划归在一起，共得到4个主要类群(A、B、C、D)(见图3)，相当于聚类分析结果的第Ⅰ类、第Ⅱ类、第Ⅲ类、第Ⅳ类，表明主成分分析结果与聚类分析结果相一致；主成分分析结果更直观地反映出油梨种质之间的亲缘关系，是对聚类结果的直观解释和旁证，两者结合能更全面地了解种质间的亲缘关系。

图3 54份油梨种质的主成分分析

3 结论与讨论

本研究结果表明，油梨种质资源具有较丰富的遗传多样性，SSR分子标记对其有较高的多态性检测能力，适用于油梨种质资源鉴定和亲缘关系分析。

油梨为国外引进物种，在我国发展百年，品种选育有所成效，但资源仍旧匮乏、适栽品种较少及消费市场有限导致油梨生产发展十分缓慢。油梨遗传多样性被认为是广泛的，但收集的种质缺乏有力的特性描述和正确鉴定的遗传信息，这在某种程度上限制了油梨的遗传改良工作进行[15]。油梨形态特征往往受环境影响较大，即使同品种的果实也可在外观表现出相当大的差异[16]，仅根据形态学标记来鉴定种族杂种是一项困难的任务。Ashworth等[13]利用25个微卫星标记对35份油梨栽培种和两个野生近缘种进行遗传差异分析；Alcaraz等[28]利用16组微卫星序列对75份油梨种质(西班牙本地品种和收集品种)进行分子鉴定和遗传多样性分析，表明所使用的SSRs具有高信息量，对油梨种质的鉴定和管理有一定的作用。可见，SSR标记已被应用于油梨的品种鉴定和分类、亲缘关系及遗传多样性研究，并具有较高的检测效率。重要的园艺性状，如砧木性能、果实质量、收获季节等都与品种有关[29]，分析了解油梨种质资源之间的亲缘关系及遗传变异，为油梨种质资源鉴定及育种亲本选择提供参考。本研究根据聚类分析和主成分分析，54份油梨种质可划分为4大类群，Fuerte单独归为第Ⅰ类，收集自广西，该种质属杂交种系；Hass、Bacon被聚为第Ⅱ类，收集自广西，传统上Hass为危地马拉系、Bacon为墨西哥系，遗传相似度为71%。有研究提出许多被认为是某个品系的“纯”油梨，实际上可能是品系杂交种，例如，Hass是目前商业上最重要的油梨品种，它看起来是典型的危地马拉品种，然而，从后代分析中估计它可能含有约15%的墨西哥品系基因[10]。Fiedler等[10]对油梨品种进行RAPD遗传关系分析研究结果表明，墨西哥品系品种和“cv.Hass”(危地马拉系与墨西哥系杂交)聚为1个类群，遗传相似度为60%，与本研究聚类结果基本一致，这说明本研究的供试Hass，可能是品系杂交种，不是“纯”危地马拉系品种。Y1-10、Y3-1、Y6-5、Y10-1聚为第Ⅲ类，均收集自海南。第Ⅳ类的种质47份，占参试材料的87.04%，收集自海南、广西、云南等地，在相似系数0.71处聚为一类，该类群中的品种Pollock为西印度系，我国选育的桂研10号、桂肯大2号、桂肯大3号、热研2号、热研3号、热研16号、热研17号也归为该类群，这说明它们与西印度系亲缘关系密切，可能来源于西印度系，该类群的其他种质也可能属于西印度系。分子标记在植物遗传资源管理中是有用的，可以对油梨种质进行更多的信息分类。收集的油梨种质遗传多样性丰富，遗传背景复杂，要明确其亲缘关系需要进行更为深入的调查和研究。要鉴定油梨种质，区分同名异物或同物异名的油梨品种，除了采用分子标记技术外，还应综合形态特征、品质性状等进一步评价分析才更为有效。