根腐病对宁夏枸杞根区土壤丛枝菌根真菌群落的影响

吕燕 王文彬 苟琪 王英娜 李靖宇 刘建利

（1. 北方民族大学生物科学与工程学院，银川 750021；2. 河北大学生命科学学院，保定 071002）

宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）属茄科枸杞属，为药食同源植物，在宁夏、青海、甘肃、新疆和内蒙古等地分布最广［1］。其果实枸杞子、叶和根含有甜菜碱、东莨菪素等药理活性物质、桂皮酸和多酸类物质以及多种维生素和氨基酸，具有抗肿瘤、降血压和防衰老的作用，为盐碱地造林和经济林的首选树种［2］。随着宁夏枸杞规模化种植面积的扩大和种植年限的增加，化肥、农药的大量使用使土壤透气性减弱，根腐病大规模发生，并有逐年加重趋势［3-4］。宁夏枸杞根腐病是一种由镰刀菌属真菌（Fusarium spp.）所引起的使植株叶片发黄、枝条萎缩严重时整株枯死的毁灭性病害，给枸杞产量和品质造成很大的经济损失［5-6］。

宁夏枸杞根腐病防治方法主要有培育抗性品种、农业管理［7］、化学杀菌剂和生物防治。在宁夏枸杞插条时可用高锰酸钾、20%抗枯宁水剂或15%混合氨基酸锌镁水剂定根；发病初期可用50%甲基托布津或50%多菌灵浇灌根部；叶片发黄、枝条萎缩、侧枝枯死的植株，立即拔除后用5%的石灰乳消毒，以防蔓延［8］。陈伶俐等［9］研究10种杀菌剂对枸杞根腐病菌的毒力发现，2.5%咯菌腈毒力最强。生物防治宁夏枸杞根腐病亦有开展，张小彦等［10］在健康枸杞植株根际土壤中分离中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）和绿僵菌（Metarhizium sp.）对枸杞根腐病菌具有良好抑制效果；宋学云等［11］在田间应用海洋芽孢杆菌可湿性粉剂和多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂对枸杞根腐病进行防治，防控效果显著，发病率分别降低81.48%和61.27%。

丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是土壤习居真菌，是植物根围微生物区系最重要的成员之一，在园艺、农作物和林业生产中，AMF既可作为生物肥料，又可作为生防药剂，提高植物对土传病害的抗性［12］，诱导植物抵抗生物胁迫［13］。李敏［14］在田间和盆栽条件下研究AMF对西瓜生长的影响以及与由根内镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.niveum引起的枯萎病发生的关系发现，接种AMF能显著促进西瓜植株的生长并降低枯萎病发病率。Jamiolkowska等［15］研究接种AMF对辣椒根腐病的生长和防治发现，接种AMF的辣椒根系发育好于接种尖孢镰刀菌的根系并提高辣椒幼苗的光合活性。AMF与其他有益微生物共同接种对病原体亦表现出更大的抵抗潜力。Nafady等［16］研究AMF和植物促生酵母（Brettanomyces naardensis）的联合作用对由Macrophomina phaseolina引起的向日葵根腐病和炭腐病的影响，结果表明，双接种通过增加植物的养分利用率来诱导免疫系统；Gao等［17］研究了接种Funnelliformis mosseae、Glomus tortuosum和根瘤菌Sinorhizobium medicae对苜蓿根腐病的联合防治效果，发现在AMF和S.medicae存在下，植株的N、P浓度均显著高于不存在AMF和S.medicae的植株；接种AMF可增加结瘤数且植物病害相关酶、过氧化物酶和过氧化氢酶含量升高。

AMF应用于植物病害的防治具有很大的应用前景，但宁夏枸杞健康植株根腐病发病后，其根区土壤AMF群落如何发生变化尚不清楚。

本研究以不同样地宁夏枸杞健康植株和根腐病发病植株根系和根区土壤为研究材料，鉴定宁夏枸杞根区土壤AMF群落组成，并分析根腐病发病后对宁夏枸杞根区土壤AMF群落组成、多样性及结构的影响，为后续开展应用AMF防控宁夏枸杞根腐病奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2019 年 8 月在宁夏银川（38°39′N，106°9′E）、宁夏中宁（37°28′N，105°37′E）和甘肃靖远（36°54′N，105°9′E）样地分别选取3个样方，在每个样方选取‘宁杞1号’品种10株健康植株和10株根腐病发病植株（根部明显腐烂，叶片变黄、萎蔫、脱落大于80%），去除表面枯枝凋落物，挖出植株，轻轻抖落根区土壤、收集根样并放入自封袋，每个样地3个生物学重复，样品编号分别为“银川Yinchuan（‘健康 树 Healthy tree’，‘ 病 树 Root rot-infected tree’）”，“ 中 宁 Zhongning（‘ 健 康 树 Healthy tree’，‘ 病 树Root rot-infected tree’）”，“靖远 Jingyuan（‘健康树Healthy tree’，‘病树 Root rot-infected tree’）”。土壤样品过2 mm筛，部分土壤样品阴干后于4℃冷藏保存，用于土壤理化性质和AMF分离鉴定；阴干根样用于AMF侵染率的测定。

1.2 方法

1.2.1 AMF分离鉴定 土壤样品风干后过2 mm筛准确称取10 g，用湿筛倾析-蔗糖离心法［18］分离AMF孢子，在体视显微镜下观察并记录孢子数量。将孢子置于浮载剂（水、乳酸甘油、PVLG）中压片处理，在光学显微镜下观察孢子大小、形态、颜色、表面纹饰、孢壁结构、连孢菌丝和内含物等特征，并拍照记录。根据国际AM真菌保藏中心（INVAM） 在 http：//invam.wvu.edu/和 http：//www.amf-phylogeny.com/上提供的最新分类描述及图片进行种属鉴定。

1.2.2 AMF多样性测定 参照刘海跃［19］的方法对AMF孢子密度、种丰度、相对多度及物种多样性指数进行计算。

孢子密度（spore density，SD）：10 g风干土中孢子数量；种丰度（species richness，SR）：10 g土样含有AMF的种数；相对多度（relative abundance，RA）：AMF某种或属的孢子数/该样地AMF总孢子数×100%；分离频度（frequency，F）：AMF某属或种出现次数/土样数×100%；重要值（important value，IV）：某样地AMF种或属分离频度与相对多度之和平均值，即IV=（F+RA）/2；根据重要值将AMF优势度划分为4个等级，即IV＞60%为优势属（种），40%＜IV≤ 60%为亚优势属（种），20%＜IV≤40%为伴生属（种），IV≤20%为偶见属（种）；

式中，S为某采样点AMF种类数，Pi为种i所占比例。

1.2.3 AMF定殖率测定 依据Phillips等［20］方法计算AMF结构定殖率。将收集的根样用蒸馏水反复冲洗3次后，置于10% KOH溶液中，于90℃水浴45-60 min；弃去KOH溶液后加入碱性H2O2，室温下放置20 min后洗去碱性H2O2；加入2%盐酸，室温酸化5 min，加入0.5%酸性品红置于90℃水浴中染色30 min，弃去染色液后，加入乳酸甘油溶液（1∶1∶1）室温下脱色24 h。随机选取30个长度为1 cm根段，压片后于电子显微镜下观察并计算AMF定殖率。

1.2.4 土壤理化性质测定 采用电位法测定pH，采用凯氏定氮法测定全氮（total nitrogen，TN），采用酸溶-钼锑抗比色法测定全磷（total phosphorus，TP），采用钼锑抗比色法测定速效磷（available phosphorus，AP），采用重铬酸钾容量法测定有机质（organic matter，OM），采用氢氟酸高氯酸销煮法测定全钾（total potassium，TK），采用醋酸铵-火焰光度计法测定速效钾（available potassium，AK），采用紫外分光光度法测定硝态氮（nitrate nitrogen，NO3--N），采用苯酚-次氯酸盐法测定氨态氮（ammonia nitrogen，NH4+-N）。采用Braford法测定土壤中易提取球囊霉素（easily extractable glomalin-related soil protein，EEG）和总球囊霉素（total glomalin-related soil protein，TG）。

1.2.5 数据统计 数据经Excel 2016处理后，用SPSS 20.0软件进行2组t检验，以P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著；用Excel 2016对AMF属种组成进行作图；用美吉生信云平台工具（https：//cloud.majorbio.com/）进行组间差异分析和PCoA分析；运用R语言（R×64 3.5.1）“vegan”包进行PERMANOVA分析；运用微生太生科云平台（https：//www.bioincloud.tech/#/）对AMF与土壤因子进行RDA分析和环境因子相关性分析。

2 结果

2.1 土壤理化性质

由表1可知，不同样地宁夏枸杞健康植株土壤与根腐病发病植株土壤全磷、氨态氮、全氮、速效钾和速效磷含量无显著性差异；银川样地健康植株土壤与根腐病发病植株有机质含量存在显著性差异，健康植株土壤低于根腐病发病植株土壤；不同样地健康植株土壤与根腐病发病植株土壤的硝态氮含量均存在显著性差异，银川和中宁样地根腐病发病植株土壤高于健康植株土壤，但靖远样地健康植株土壤高于根腐病发病植株土壤；靖远样地全钾含量存在显著性差异，健康植株土壤高于根腐病发病植株土壤；中宁样地健康植株土壤与根腐病发病植株pH存在显著性差异，根腐病发病使中宁样地土壤pH升高。由表1可知，根腐病发生与土壤理化因子中有机质含量呈显著正相关。

表1 不同样地宁夏枸杞健康与根腐病发病植株土壤理化性质Table 1 Physicochemical properties of soil around healthy and root rot-infected L. barbarum L. plants from different cultivated sites

2.2 AMF孢子密度、侵染率与球囊霉素

由表2可知，银川样地健康植株和发病植株土壤AMF孢子密度分别为9.77个/g和9.70个/g，AMF总侵染率分别为2.50%和7.72%，土壤样品孢子密度和AMF总侵染率最低；中宁样地健康植株和发病植株土壤AMF孢子密度分别为34.90个/g和36.40个/g，AMF总侵染率分别为10.27%和17.85%；靖远样地健康植株和发病植株土壤AMF孢子密度分别为36.30个/g和42.67个/g，AMF总侵染率分别为30.00%和33.23%，3个样地健康植株和发病植株土壤AMF孢子密度和AMF总侵染率无显著变化。

表2 不同样地宁夏枸杞健康与根腐病发病植株土壤AMF孢子密度、侵染率和球囊霉素Table 2 AMF spore density，infection rate and glomalin content in the soil of healthy and root rot plants of L. barbarum L.from different cultivated sites

不同样地健康植株和发病植株土壤易提取球囊霉素和总球囊霉素存在差异。银川样地健康植株和发病植株土壤易提取球囊霉素分别为20.71 mg/g和29.37 mg/g，总球囊霉素分别为57.16 mg/g和70.5 mg/g；中宁样地健康植株和发病植株土壤易提取球囊霉素分别为18.09 mg/g和24.42 mg/g，总球囊霉素分别为61.74 mg/g和67.65 mg/g；靖远样地健康植株和发病植株土壤易提取球囊霉素分别为12.54 mg/g和22.42 mg/g，总球囊霉素分别为50.50 mg/g和55.76 mg/g。中宁样地健康植株土壤易提取球囊霉素含量显著小于发病植株土壤。

因此，宁夏枸杞健康植株受根腐病病原菌入侵后，AMF孢子密度、总侵染率和总球囊霉素含量不发生显著变化，中宁样地宁夏枸杞健康植株根腐病发病后易提取球囊霉素含量升高。

2.3 AMF孢子形态

在3个样地共分离到AMF 6属32种，包括无梗囊霉属（Acaulospora）9种；近明球囊霉属（Claroideoglomus）4种；球囊霉属（Glomus）11种，未定种3种；根孢囊霉属（Rhizophagus）1种；盾巨孢囊霉属（Scutellospora）1种；隔球囊霉属（Septoglomus）3种（图1）。其中，银川健康植株土壤样品鉴定出4属16种，银川根腐病发病植株土壤样品鉴定出5属17种，中宁健康植株土壤样品鉴定出6属22种，中宁根腐病发病植株土壤样品鉴定出6属19种，靖远健康植株土壤样品鉴定出4属18种，靖远根腐病发病植株土壤样品鉴定出5属16种。

图1 AMF孢子形态Fig.1 Spore morphology of AMF

2.4 AMF群落组成

由图2可知，在属水平，不同样地样品AMF的组成存在差异。银川样地健康和发病植株、中宁样地健康植株和靖远样地健康植株土壤优势属为球囊霉属，但靖远样地发病植株土壤优势属为无梗囊霉属，中宁样地发病植株土壤优势属为根孢囊霉属；中宁样地健康植株土壤次优势属为根孢囊霉属，发病植株土壤为无梗囊霉属，近明球囊霉属仅在中宁样地出现；靖远样地健康植株土壤次优势属为无梗囊霉属，发病植株土壤次优势属为球囊霉属。

图2 属水平不同样地宁夏枸杞健康与根腐病发病植株根区土中AMF相对丰度图Fig.2 Relative abundance of AMF community at genus level among healthy and root rot-infected plants of L. barbarum L. from different cultivated sites

因此，宁夏枸杞植株受根腐病病原菌侵染后，银川样地宁夏枸杞根区土壤AMF优势属未发生改变，中宁样地优势属从球囊霉属变为根孢囊霉属，靖远样地优势属从球囊霉属变为无梗囊霉属，各属的相对丰度在健康和罹病植株之间无显著差异。

在种水平，地表球囊霉（G. versiforme）为银川样地健康和发病植株根区土壤的优势种；中宁样地健康植株根区土壤的优势种为明根孢囊霉（R.clarus）；但靖远样地健康植株根区土壤优势种为大果球囊霉（G. macrocarpum），发病植株根区土壤的优势种为细凹无梗囊霉（A. scrobiculata）。黑球囊霉（G.melanosporum）、网状球囊霉（G. reticulatum）、地表球囊霉（G. versiforme）和缩隔球囊霉（S. constrictum）为所有样地健康植株和病树植株根区土壤AMF的共有种（表3）。结果表明，根腐病造成靖远样地优势种发生变化，从大果球囊霉变为细凹无梗囊霉，但对银川样地和中宁样地优势种无显著影响，银川样地仍为地表球囊霉，中宁样地仍为明根孢囊霉。

表3 种水平AMF空间分布重要值Table 3 Important value of spatial distribution of AMF at species level

组间差异物种显示，根腐病造成银川样地网状球囊霉（G. reticulatum）和凹坑球囊霉（A. excavate）相对丰度显著降低，细凹无梗囊霉（A. scrobiculata）、多梗球囊霉（G. multicaule）和扭形球囊霉（G.tortuosum）相对丰度显著上升（图3-A）；中宁样地健康植株根区土壤AMF占比显著大于根腐病发病植株的有黏质隔球囊霉（S. viscosum）、大果球囊霉（G.macrocarpum）和蜜色无梗囊霉（A. mellea），根腐病发病植株根区土壤AMF占比显著大于健康植株的有近明球囊霉（C. luteum）、明根孢囊霉（R. clarus）和扭形球囊霉（G. tortuosum），根腐病造成黏质隔球囊霉、大果球囊霉、蜜色无梗囊霉相对丰度显著降低，明根孢囊霉相对丰度显著升高（图3-B）；靖远样地健康植株根区土壤AMF占比显著大于根腐病发病植株的有大果球囊霉（G. macrocarpum）和G. sp1，根腐病发病植株根区土壤AMF占比显著大于健康植株的有细凹无梗囊霉（A. scrobiculata）、沙荒隔球囊霉（S. deserticola）和凹坑无梗囊霉（A. excavate），根腐病造成大果球囊霉和G. sp1相对丰度显著降低，细凹无梗囊霉、沙荒隔球囊霉和凹坑无梗囊霉相对丰度显著升高（图3-C）。

图3 种水平不同样地宁夏枸杞健康与根腐病发病植株根区土中AMF差异物种Fig. 3 AMF differentiated species in the root zone soil of L. barbarum L. healthy and root rot-infected plants at species level

2.5 AMF群落α-多样性

由表4可知，银川样地宁夏枸杞健康植株和发病植株根区土壤AMF物种丰度分别为11.00和13.00，中宁样地分别为16.00和13.33，靖远样地分别为14.00和13.67，3个样地AMF物种丰度均无显著差异。银川样地宁夏枸杞根腐病发病后宁夏枸杞根区土壤AMF香农威纳指数显著升高，中宁样地和靖远样地宁夏枸杞根腐病发病后香农威纳指数呈下降趋势，但不存在显著性差异。因此，根腐病发病后，银川样地宁夏枸杞根区土壤AMFα-多样性升高，中宁样地和靖远样地α-多样性无显著变化。

表4 不同样地宁夏枸杞健康和根腐病发病植株根区土壤AMF物种丰度和α-多样性Table 4 AMF species richness and α-diversity in soil of healthy and infected plants of L. barbarum L. from different cultivated sites

2.6 AMF群落β-多样性

基于Bray-Curtis距离的PCoA分析（principal co-ordinates analysis）结果（图4）显示，银川样地宁夏枸杞健康植株和发病植株根区土壤AMF群落组成更相似，中宁样地和靖远样地宁夏枸杞健康植株和发病植株根区土壤AMF群落组成存在差异；PERMANOVA分析显示不同样地宁夏枸杞健康植株和发病植株根区土壤AMF群落组成差异显著（R2=0.875，P=0.001）。结果表明，宁夏枸杞根腐病发病后根区土壤AMF群落组成发生改变。

图4 基于Bray-Curtis距离AMF群落的PCoA图Fig.4 PCoA plot based on Bray-Curtis similarities of AMF community

2.7 RDA分析根腐病对土壤理化因子与根区土壤AMF关系的影响

对土壤理化性质各项指标进行RDA分析，在银川样地，速效钾是健康植株根区土壤AMF分布的主要影响因子，有机质是罹病植株根区土壤AMF分布的主要影响因子（图5-A）；在中宁样地，硝态氮是健康植株根区土壤AMF分布的主要影响因子，全氮和氨态氮是罹病植株根区土壤AMF分布的主要影响因子（图5-B）；在靖远样地，全磷是健康植株根区土壤AMF分布的主要影响因子，全钾和硝态氮是罹病植株根区土壤AMF分布的主要影响因子（图5-C）。

图5 AMF群落与土壤理化因子RDA分析Fig. 5 Redundancy analysis between AMF community and soil physicochemical properties

综上所述，根腐病发生改变了影响宁夏枸杞根区土壤AMF群落的土壤理化因子。

2.8 AMF物种多样性与土壤理化性质的相关性

AMF物种多样性和环境因子相关性分析表明（表5），速效磷含量与孢子密度呈显著负相关，速效钾含量与种丰度呈显著负相关，其余土壤理化性质与孢子密度和种丰度无显著相关性；pH与AMF总侵染率呈显著正相关，其余土壤理化性质与AMF侵染率无显著相关性；所有土壤理化性质与Shannon-Wiener指数无显著相关性。

表5 AMF物种多样性和环境因子相关性分析Table 5 Correlation analysis between species diversity of AMF and environmental factors

3 讨论

对枸杞根系土壤中AMF群落的研究已有开展。其中唐明等［21］用湿筛倾析法筛取VA菌根真菌的孢子和孢子果，发现宁夏中卫地区的枸杞（L. chinense）根系土壤中优势种为双型球囊霉（G.ambisporum），地球囊霉（G. geosporum）为少见种，单孢球囊霉（G. monosporum）为偶见种。刘洪光［22］采用湿筛倾析法对银川产区宁夏枸杞（L. barbarum L.）根际土AMF孢子鉴定发现球囊霉属为优势属。张海涵［23］采用巢式PCR-DGGE和克隆测序技术研究发现黄土高原旱区不同品种枸杞根系AMF均属于球囊霉属。盛敏［24］运用湿筛倾析法研究宁夏平罗盐碱土生境中枸杞（L. chinense）根际土壤AMF群落的有6个种，地表球囊霉（G. versiforrm）所占比例最高。本研究中银川、中宁、靖远样地宁夏枸杞健康植株和银川样地发病植株根区土壤AMF优势属均为球囊霉属，与刘洪光［22］研究结果一致，银川样地健康植株和发病植株根区土壤AMF优势种为地表球囊霉（G. versiforrm），与盛敏［24］研究结果一致；中宁样地发病植株根区土壤AMF优势属发生变化，发病植株优势属为明根孢囊霉属，优势种为明根孢囊霉（R. clarus），靖远样地优势属种为无梗囊霉属凹坑无梗囊霉（A. excavate）。

赵蕾［25］对典型喀斯特区玉米纹枯病及根际土壤AMF群落特征调查时发现球囊霉属和原囊霉属（Archaeospora）的相对丰度表现为健康植株高于感病植株，本研究结果与其一致，发现银川样地健康植株优势属均为球囊霉属，且比例存在下降趋势。宋放等［26］采用高通量测序技术研究赣州橘园根系AMF多样性受黄龙病菌侵染影响时发现黄龙病菌侵染能够显著改变柑橘根系内生AMF的群落结构，但对其总体丰度和多样性无显著影响。本研究发现中宁、靖远样地宁夏枸杞根区土壤AMF α-多样性受根腐病菌影响不大，AMF多样性无显著变化；但银川样地宁夏枸杞受根腐病病原菌侵染后AMF α-多样性显著升高。张智慧等［27］对健康三七和根腐病三七根内AMF和DSE侵染状况研究发现，健康三七的AMF侵染率显著高于根腐病三七，AMF提高了三七的抗根腐病能力。本研究发现3个宁夏枸杞样地健康植株和根腐病发病植株AMF侵染率无显著差异，根腐病病原菌侵入宁夏枸杞根系后对AMF侵染率无影响。AMF物种多样性与环境因子相关性显示，土壤pH与AMF侵染率呈显著正相关，根腐病发病土壤酸碱度发生变化会影响AMF侵染率。

土著AMF长期存在于土壤中，已适应土壤的生态条件具备良好的生存优势［28］。使用AMF有助于在可持续和综合的土壤传播疾病管理中预防土传疾病的发生［29］，病原入侵前植物与AMF建立共生体可提前诱导寄主的抗病防御体系［30］。选取AMF菌种作用于植株时应考虑土著AMF菌种。本研究发现靖远样地健康植株AMF丰度大于发病植株，显著差异种有大果球囊霉（G. macrocarpum）和G. sp1，银川样地显著差异种有网状球囊霉（G. reticulatum）和凹坑无梗囊霉（A. excavate），中宁样地显著差异种有黏质隔球囊霉（S. viscosum）、大果球囊霉（G.macrocarpum）和蜜色无梗囊霉（A. mellea），后续试验可对上述不同样地健康植株根区土壤AMF种进行筛选并建立土著AMF菌剂，进一步探究土著AMF对宁夏枸杞根腐病的作用。

有研究表明，土壤理化性质通过影响AMF产孢影响其多样性。如盛敏［24］研究发现AMF种的丰度和多样性指数随土壤养分（有机质、速效磷、速效钾和碱解氮）的增加而降低，本研究也发现速效磷含量与孢子密度显著负相关，速效钾含量与种丰度显著负相关，与盛敏研究结果一致，速效磷含量低的土壤更利于AMF产孢。

4 结论

根腐病发生改变宁夏枸杞根区土壤AMF群落结构，但对α-多样性指数、优势类群、物种组成等各个群落结构特征在不同样地之间影响不同。土壤理化性质不影响AMF物种多样性，但影响AMF定殖。