一株枯草芽孢杆菌降解黄曲霉毒素B1产物分析

唐璎 黄佳 邓展瑞 杨晓楠

（甘肃省产品质量监督检验研究院，兰州 730050）

黄曲霉毒素（aflatoxin，AFT）是一类对肝脏及免疫系统有强抑制性，对人畜有高致癌、致突变、致畸性的真菌毒素［1］。其中黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是已发现的AFT中毒性及致癌性最强的，1993年国际癌症研究机构（IARC）将AFB1划分为I类致癌物［2］。AFB1分子有3个毒性结构，分别是呋喃环双键，香兰素内脂环和戊烯酮环［3-4］。目前，食品中常用的AFB1吸附方法有物理法，化学法，生物法及基因干预4种方法。生物法去除AFB1效率最高，特异性最强，污染最小。生物利用本身特异性结构或代谢产物吸附、修饰、破坏AFB1毒性分子结构，达到去除毒素的效果［5-6］。

目前对生物降解AFB1产物分析较少，邵帅等［7］分析筛选到的霉菌HSK8降解AFB1后，AFB1荧光减弱，产生新的荧光物质，菌株降解AFB1后产物也具有荧光特性。Samuel等［8］通过气相色谱质谱联用仪及傅里叶红外光谱仪发现恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）降解AFB1后产物产生低毒性化合物AFD1，AFD2和AFD3，菌株降解AFB1结构中呋喃、内脂环和戊烯酮环等结构。Eshelli等［9］发现红平红球菌菌株（Rhodococcus erythropolis）降解AFB1途径是经过脂肪酸代谢和糖发酵积累中间体形成分子式为C13H16O4的芳香族化合物。张晓雪等［10］筛选的新型黑曲霉FS-UV1（Aspergillus Niger FSUVI）降解产物通过动物实验证明降解产物为低毒性化合物。但是综上研究对菌株降解产物的结构研究较少，不能明确降解产物的究竟是哪种化合物，以及分子结构，也不能有效分析菌株降解AFB1的机制，且对产物毒性分析研究不足。

本研究以实验室前期筛选的一株可降解AFB1的枯草芽孢杆菌WTX1（Bacillus subtilis WTX1）为研究对象，利用液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪（UPLC-MS/MS）及核磁共振氢谱（1H NMR）检测菌株WTX1降解AFB1产物，两种方法互相验证，明确降解产物结构，预测菌株WTX1降解机制，同时进行细胞实验，评估降解产物对细胞代谢毒性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、细胞来源 实验室前期采集青藏高原牦牛粪，从中分离出一株AFB1降解率为83.5%（AFB1浓度为10 μg/mL的培养液）的芽孢杆菌属菌株WTX1，该菌株4℃保藏于营养琼脂斜面。

L-02（正常人体肝细胞）细胞由中国科学院细胞保存库传代保存。

1.1.2 主要试剂

（1）培养基与试剂。胰蛋白胨大豆琼脂培养基TSA（CM168），胰蛋白胨大豆肉汤 TSB（CM301），磷 酸 缓 冲 盐 溶 液（phosphate buffer saline，PBS）（CM1022）由北京陆桥提供。RPMI 1640细胞培养基（Cat No：27016021）美国Gibco；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Cat No：26140），美国 Gibco；0.05%trypsin-EDTA（Cat No：25300054）美国 Gibco。

（2）UPLC-MS/MS试 剂。 乙 晴（ 色 谱 纯，sigma）；二氯甲烷（色谱纯，sigma）；甲醇（色谱纯，sigma）；苯（色谱纯，sigma）。

（3）核磁共振氢谱（1H NMR）：氘代氯仿-D 0.03%TMS（侨怡生物科技（上海）有限公司）。

（4）AFB1标准溶液（色谱纯，sigma）；AFB1-MRS/RPMI 1640溶液（浓度10 μg/mL）：将AFB1加入灭菌后的MRS/RPMI 1640培养基中，浓度为10 μg/mL。

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1.1.3 仪器设备 超高效液相色谱串联三重四级杆质谱联用仪（QTRAP 4500），SCIEX；核磁共振波谱仪（AVANCE III 400），瑞士布鲁克，兰州大学功能有机分子化学国家重点实验室；立式蒸汽灭菌器（LDZF-50KB-II），上海申安医疗器械厂；电子天平（TLE204E102），瑞士梅特勒托利多；恒温培养箱（MIR-H163-PC），日本松下；超净工作台（SWCJ），苏州安泰空气技术有限公司；恒温培养摇床（Stab Mini），上海润度生物科技有限公司；倒置显微镜（TS100），日本尼康；细胞计数分析仪（Vi-CELL XR），贝克曼库尔特。

1.2 方法

1.2.1 菌株降解液检测 将纯化的WTX1菌株，制备浓度为107CFU/mL菌悬液（PBS，pH7.4），取50 mL接种于500 mL AFB1-TSB培养液中（10 μg/mL），30℃避光发酵72 h后，收集上清液（12 000 r/min，15 min，4℃）。取1 mL上清液，用等体积二氯甲烷涡旋振荡萃取3次，萃取液在55℃条件下氮吹干燥。用1 mL甲醇（GR）溶解沉淀，0.22 μm有机相滤膜过滤，涡旋混匀进样。用UPLC-MS/MS方法检测上清液中残留的AFB1含量，测量菌株AFB1降解率。利用公式［11-12］：

S：菌株AFB1降解率，%；C：接种菌株发酵一段时间后样品中剩余AFB1对应峰面积；F：对照样品中（未接种菌株发酵）AFB1对应峰面积。

1.2.2 UPLC-MS/MS质谱条件 参照唐璎等［11］方法条件。色谱条件：C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱箱温度：40℃；流动相（乙酸铵/甲醇）液相色谱梯度洗脱。质谱条件：电离方式：电喷雾电离（electrospray i-onization，ESI+）；检测方式：多反应监测模式（multi-polyreaction monitoring，MRM）；气帘气（CUR）：35 psi；碰撞气（CAD）：medium；离子化电压（IS）：5 500V；离子源温度：550℃；喷雾气（GSI）：55 psi；辅助 加热器（GS2）：60 psi，以不含AFB1标准溶液发酵液做对照，扣除降解产物图谱中基质的干扰。

1.2.3 菌株WTX1降解产物分析 优化李文明等［13］方法，取30℃发酵72 h菌株降解AFB1降解液，离心（8 000 r/min，15 min，4℃）分离上清液。上清液前处理同1.2.1中步骤。采用UPLC-MS/MS检测菌株WTX1降解上清液，采集降解液总离子流图，将总离子流图峰值顶点的质谱图，导入NTST MS search 2.2软件，降解液中化合物质谱图与标准质谱图进行对比，分析降解产物可能的结构，初步预测菌株WTX1的降解机制。

1.2.4 菌株降解产物核磁共振波谱法（1H NMR）检测 参考杨登辉等［14］方法，取20 μL降解液于玻璃离心管中，加入氘代氯仿-D 0.03%TMS溶液0.5 mL，震荡均匀，待测。核磁共振条件：测试温度25℃，以TMS内标物校准化学位移零点，扫描次数=64，谱线宽度=0.4 Hz，采集时间：8 min 50 s，工作频率为400.14 MHz，光谱宽度为8 023.75 Hz。采用1H NMR法测定AFB1及菌株降解产物谱图，并用TopSpin软件扣除产物中AFB1标物图谱，分析产物中主要物质结构，与UPLC-MS/MS检测结果做验证。

1.2.5 菌株降解产物毒性分析 取第一次WTX1菌株降解液，进行二次降解，确保在菌株降解产物进行细胞毒理试验之前，降解液中无原始添加的AFB1标液残留量，避免影响评估降解产物的细胞毒性。用UPLC-MS/MS检测降解液中AFB1含量，降解液中AFB1含量低于检出限（＜0.03 μg/L）。

1.2.5.1 细胞倍增时间检测 正常的L-02人体肝细胞倍增时间为20 h，细胞在培养过程中受诱导突变的化合物影响，倍增时间会发生改变，检测菌株WTX1降解AFB1降解液是否对细胞具有诱变性［15］。参照组：用RPMI 1640培养液培养L-02标准细胞；对照组：AFB1-RPMI 1640溶液（AFB1浓度10 μg/mL）培养L-02标准细胞；试验组：100 mL RPMI 1640培养液中加入10 mL菌株WTX1降解液培养L-02标准细胞；计算3组实验中细胞的倍增时间。L-02细胞接种密度为5×104/ cm2，在24 孔板中先每个孔加入有血清的培养物，然后每个孔加入100 μL（细胞浓度0.1×106cells/mL），并且同时接3块24孔板，分别在37℃，5%CO2，培养3 d，培养第1、2、3天消化计数，以细胞总数为纵坐标，培养时间为横坐标，计算不同培养物中L-02细胞倍增时间。细胞倍增时间用公式（2）计算［16］。

1.2.5.2 细胞形态分析 在培养第1、2、3天，取接种培养在24孔板的参照组、对照组和试验组细胞，在显微镜下观察细胞形态，比较3组细胞形态变化。

1.2.5.3 细胞活性分析 利用细胞计数分析仪，在计数的同时，计算活细胞占比，比较参照组，对照组和试验组3种培养物对细胞活性的影响。

1.2.6 数据处理 实验结果采用minitab与Excel软件进行极差、单因素方差分析，每组实验重复6次，采用单因素方差分析数据间差异，显著性水平设定为 P＜0.05［17］。

2 结果

2.1 菌株WTX1降解AFB1产物结构

采用UPLC-MS/MS方法，分析菌株WTX1降解AFB1产物成分，降解液总离子流图中有6个明显峰值，如图1所示。将降解液总离子流图与AFB1标准溶液培养物总离子流图做对比，用不添加AFB1的发酵液扣除基质影响，AFB1标准品谱图如图2所示。根据保留时间及峰值顶点的质谱图，总离子流图中第6个峰代表化合物AFB1。其余峰值顶点质谱图与NTST MS search 2.2软件标准谱库做对比，根据保留时间和碎片离子大小，产物1-5与AFB1有若干相同碎片离子，如39，51，63，77等，AFB1标准物质总离子流图中保留时间5.3 min的峰与菌株降解液总离子流图中相近时间产物2峰的全质谱图比较，两者为不同物质，且无重叠。据此可以判断，降解液总离子流图中峰值高的化合物1-5是菌株WTX1降解AFB1的产物，且有较高的同源性。根据NTST MS search 2.2软件质谱图对比结果，产物1-5可能的结构如图3所示，分别是产物1：C3H4，m/z：40.0313；产物2：C6H6，m/z：78.0469；产物3：C7H8O2，m/z：78.0469；产 物 4：C8H6O2，m/z：134.03677；产物5：C11H10O4，m/z：206.057909。

图1 菌株降解液总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of strain degradation fluid

图2 AFB1标准物质总离子流图（A）及质谱图（B）Fig.2 Total ion flow chromatogram（A）and mass spectrum（B）of AFB1 standard material

图3 降解上清液提取质谱图及产物结构图Fig.3 Mass spectrogram of degradation supernatant extracts and product structure

2.2 菌株降解产物核磁共振波谱（1H NMR）分析

采用1H NMR法测定AFB1及菌株降解产物谱图，并用TopSpin软件扣除产物中AFB1标物图谱，分析产物中主要物质结构，产物结构主要是碳氢单链（图4中结构式1-2），亚甲基（图4中结构式3），苯环（图4中结构式4），苯环与呋喃环（图4中结构式5）。将核磁共振氢谱谱图结果与UPLC-MS/MS软件预测结果对比，菌株降解AFB1主要产物结构两者基本一致，仅产物3结构略有不同，核磁共振氢谱谱图中C=O位置处多2个-H键。核磁共振氢谱谱图能更好的反应产物结构式，产物结构以核磁共振结果为准。但是UPLC-MS/MS方法可以通过质谱分析离子碎片，佐证降解液中主要产物1-5与AFB1之间离子的同源性，确认降解液中1-5化合物是菌株分解AFB1的产物。

图4 菌株降解液核磁共振氢谱谱图及主要物质结构示意图Fig.4 1H nuclear magnetic resonance spectrum of strain degradation fluid and schematic diagram of main material structures

2.3 预测菌株WTX1降解AFB1机制

通过软件比对WTX1降解AFB1产物质谱图，得到5种含量较高产物可能的结构式，在这5种产物结构中不存在AFB1致毒性强的呋喃环双键，香兰素内脂环和戊烯酮环结构。推测WTX1降解机制是转化AFB1中致毒性强的结构，达到降解毒素的效果。预测菌株降解AFB1机制如图5所示，菌株降解AFB1是通过2次裂解完成的，一级裂解是将AFB1结构中香兰素内脂环（10，11，15位点）和戊烯酮环（14位点）结构直接从AFB1母体上裂解，同时将8，9位的呋喃环结构破坏修饰，形成产物5（C11H10O4）；二次裂解是将产物5中苯环和-C=C-C=O-链断开，形成产物4（C8H6O2）和产物3（C7H8O2）；一二级裂解会产生副产物即产物1（C3H4）和产物2（C6H6）。为验证AFB1因毒性结构被破坏，达到降低毒性的效果，对WTX1菌株降解液进行细胞毒理试验。

图5 预测菌株WTX1降解AFB1机制Fig. 5 Predictive mechanism of strain WTX1 degrading AFB1

2.4 菌株WTX1降解AFB1产物毒性分析

2.4.1 WTX1菌株AFB1降解产物对细胞生长的影响 利用细胞计数分析仪，在培养1 d、2 d、3 d分别对3组实验进行细胞计数。根据表1所示，实验组与参照组相比，参照组培养的L-02细胞倍增时间约21 h-22 h，试验组细胞倍增时间也为21 h-22 h，两组之间倍增时间无差异性（P＞0.05），细胞增长量无差异（P＞0.05），说明WTX1菌株降解AFB1产物对细胞不具有诱变性。试验组与对照组相比较，对照组随培养时间延长，倍增时间增加，细胞增长缓慢，从培养第2天开始，细胞大量凋亡，说明AFB1对细胞有强致毒和变异性；菌株WTX1降解AFB1产物对细胞影响不显著，达到显著解毒效果。

表1 降解产物对细胞L-02细胞生长的影响Table 1 Effects of degraded products on the growth of L-02 cells

2.4.2 WTX1菌株AFB1降解产物对细胞形态的影响 在培养1 d、2 d、3 d时，观察细胞形态，如图6所示。参照组细胞形态呈上皮样细胞标准形态，具有桥粒和张力厚纤维。试验组细胞形态无变化，与参照组培养的L-02细胞一致。对照组细胞生长率减缓，培养第2天，细胞数量无明显增长，细胞形态变长，有溶解现象，细胞活力变弱。培养第3天，细胞自然凋亡。说明AFB1毒素对细胞毒性很强，能促使细胞变异死亡，而菌株降解AFB1的产物，毒性大大降低，对细胞基本无毒害。

图6 不同培养基下细胞形态变化Fig.6 Morphological changes of cells in different media

2.4.3 WTX1菌株降解AFB1产物对细胞活性的影响 在培养1 d、2 d、3 d时，根据细胞计数分析仪数据，比较参照组，试验组，对照组细胞活力。参照组细胞具有较好活力（98%-99%）。试验组细胞活力很好（98%），与参照组培养的L-02细胞活力相似。对照组细胞活力逐渐减弱，第3 天细胞活力只有23%，细胞在培养过程中逐渐凋亡，如图7所示。菌株WTX1菌株降解AFB1的产物不影响细胞活力，细胞可以正常生长。

图7 不同培养基培养细胞活性比较Fig.7 Comparison of cell activities in different media

3 讨论

赵春霞等［18］研究AFB1有3个致毒、致变异的结构，分别是呋喃环双键、香豆素内脂环、环戊烯酮结构。本实验证实菌株降解AFB1，破坏这3个致毒、致畸变结构后，产物毒性减弱，明确菌株WTX1的致毒机理。

Rao等［19］用筛选到的CFR1地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis CFR1）降解AFB1，等到的产物通过HPLC、高效液相色谱法和ESI-MS分析，降解产物荧光消失，证明AFB1被转化无其他未知物质。本实验用UPLC-MS/MS检验方法延伸Rao等［19］的实验。检测采集菌株WTX1降解AFB1产物的总离子流图和质谱图，创新用NTST MS search 2.2软件进行比对，明确产物种类和结构，并分析菌株降解机制，证实菌株将AFB1的3个毒性结构降解，产生小分子化合物，达到降解的效果。

参考张丹枫，杨登辉等［14，20］，利用核磁共振氢谱检验手段确定化合物结构，并验证UPLC-MS/MS质谱结果，结果表明两者检测产物结构基本相同，核磁共振氢谱检验更准确，但是UPLC-MS/MS质谱可以通过分析质谱离子碎片，溯源降解液中化合物和AFB1化合物之间的同源性，佐证降解液中化合物是AFB1的降解产物。

Samuel等［8］筛选的恶臭假单菌（Pseudomonas putida）降解AFB1产物采用气相色谱-质谱和红外光谱检测后，发现AFB1的脱毒机制是通过呋喃，内脂环的修饰和戊烯酮环丢失，转化为结构不同且毒性较低的新化合物（AFD1，AFD2和AFD3）。这与本实验研究的WTX1菌株脱毒机制略微不同。WTX1菌株是通过生物降解AFB1，将致突变结构呋喃双键，香豆素内脂环及戊烯酮环结构破坏，重新成为小分子的化合物。经过细胞毒理试验，降解后的小分子产物无细胞毒性。

本实验用L-02细胞为研究对象，验证菌株WTX1降解AFB1产物对细胞的毒性。因为AFB1毒素对肝脏细胞损害最多［21］，所以研究选用正常人体肝细胞L-02作为实验对象，更灵敏反应降解产物对细胞的毒性。并且实验前，进行二次降解，确保前期添加的AFB1无残留，避免影响降解产物细胞毒理分析。实验用AFB1降解菌株是前期从青藏高原牦牛粪中筛选到的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），该类菌株为食品中常用的发酵菌株，是食品级微生物，相较多数研究筛选的嗜麦芽窄食单胞菌［22］、假蜜环菌［23］、孢霉［24］、红蹿红球菌［25］及绿色木霉等菌株［26］，本实验用菌株更具有食品安全性。

Wang等［27］从一株YK-624白腐真菌（Phanerochaete sordida）中纯化的锰过氧化物酶，通过降解AFB1的8，9-不饱和碳-碳键生成AFB1-二氢二醇，达到脱毒的效果。本实验筛选到的WTX1枯草芽孢杆菌通过降解AFB1中3个毒性位点结构，产生无毒的降解产物，达到脱毒目的，后期会分离纯化菌株及代谢产物，明确菌株脱毒起主要作用的物质。

4 结论

本研究以实验室前期筛选到的枯草芽孢杆菌WTX1为研究对象，通过UPLC-MS/MS及1H NMR方法，分析菌株降解AFB1产物结构，得到菌株WTX1降解AFB1的机制是通过两次裂解，破坏AFB1结构中的呋喃双键，香豆素内脂环及戊烯酮环，产生小分子化合物。对降解产物进行细胞毒理实验，发现WTX1降解AFB1的产物对细胞无致突变性，无毒性。