腐殖酸煤对牛粪好氧堆肥臭气释放量及微生物群落多样性的影响

赵旭 王文丽 李娟

（甘肃省农业科学院土壤肥料与节水农业研究所，兰州 730070）

好氧堆肥是处理有机固体废弃物最经济、最有效的方法，其在人为控制的条件下（适宜的碳氮比、含水率、曝气速率、有机物含量、pH和温度等参数），利用自然界存在的微生物降解有机废弃物，形成稳定的高腐殖化物质［1］。然而好氧堆肥过程常常释放大量臭气，如NH3、挥发性含硫化合物（VSCs）等，不仅污染了环境，而且阻碍了有机固体废弃物堆肥化处理的应用和推广［2-3］。氨气是恶臭的主要成分，通过控制氨气挥发可以降低恶臭，提高堆肥产品的含氮量［4］。堆肥产生的VSCs中占比最大的是H2S，占VSCs总量的39.0%-43.0%，H2S具有臭气指数高（1.7×107），低嗅阈值（0.000 7 mg/m3）的特点，对人体及环境的影响巨大［5-6］。梁美生等［7］通过高温水热化学改性与硫酸铜溶液浸渍联合对活性炭进行改性，改性后的活性炭对硫化氢具有较好的吸附效果。研究表明添加含碳高的物质能够提高堆肥氮的含量，降低氮素损失［8］。王芳等［9］研究发现在奶牛粪中添加9%的干鸡粪和25%的褐煤能够促进堆肥腐熟进程，降低氨气释放量。孙志华等［10］研究发现，蘑菇渣牛粪堆肥原料中加入腐殖酸煤，可加快堆肥腐熟，降低氮素损失，增加钾的累积。西北地区的腐殖酸煤不仅储量丰富而且品质好，一些矿区的腐殖酸煤HA（腐殖酸）量达80%以上，在农业中具有广阔的应用前景。腐殖酸作为一种天然高分子有机物质，具有改良土壤、增加土壤团粒结构、改善土壤保水能力等功能［11］。研究发现，在植物生长过程中，腐殖酸对根系生长的刺激作用是其对植物产生刺激作用的最初动力［12］。在堆肥发酵过程中，不同时期的功能微生物数量和多样性结构变化影响着堆肥基质的分解与转化，从而对堆肥效果及质量产生显著影响［13］。然而加入腐殖酸煤后对牛粪堆肥过程臭气释放量及微生物群落多样性的影响研究较少，因此本文以鲜牛粪为原料，对比不加腐殖酸煤与加5%、10%、15%腐殖酸煤对好氧堆肥过程中臭气释放量及微生物群落多样性的影响效果，为进一步开发利用腐殖酸煤及研发畜禽粪便的除臭保氮技术提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用鲜牛粪取自兰州市红古区某奶牛场，主要成分如表1所示。

表1 堆肥原料的主要成分Table 1 Main ingredients of the material composting

1.2 方法

1.2.1 试验设计 试验设4个处理，分别为：处理1：牛粪；处理2：牛粪+5%腐殖酸；处理3：牛粪+10%腐殖酸；处理4：牛粪+15%腐殖酸；每个处理设置3个重复。调节含水量在58%左右，混料3次使牛粪与腐殖酸煤充分混合均匀，采用槽式堆肥方式，堆体长2.2 m，宽1.8 m，高1.2 m。

1.2.2 测定指标及方法

1.2.2.1 温度及理化指标的测定 每天上午10：00在堆体25 cm、50 cm的深度测定温度，取测定温度的平均值来代表堆肥过程的温度变化。pH、有机碳、全氮的检测参考 NY525-2012《有机肥料》中的方法；种子发芽指数的检测参照朱新梦等［14］的方法。

1.2.2.2 氨挥发的捕获装置及计算方法 氨挥发的捕获装置参考袁玉玲的方法改进［15］，主要组件包括 1个圆柱形气室（高20 cm，内径16 cm，白色，PVC材质）、2层圆形吸收海绵（直径16 cm，厚3 cm，聚氨基甲酸乙酯材质。测定时在下层海绵的氨气吸收层均匀涂布20 mL磷酸甘油混合液（50 mL磷酸+ 40 mL丙三醇，定容至1 000 mL），吸收挥发的氨气。下层海绵距管底5 cm高度处，上层海绵与硬质塑料管顶端平齐。在堆体的不同位置，分别放置3个通气法氨捕获装置，吸收2 h后取样。取样时，将下层的海绵取出，迅速按试验处理号装入自封袋中，密封。将吸收氨气的海绵带回试验室后，装入1 000 mL的广口瓶中，加300 mL 1.0 mol/L的KCl溶液，振荡1 h，浸取液中的铵态氮用流动注射分析仪测定。通过以下公式计算氨气挥发量：

式中，f为氨气排放量［mg/（m2·h）］；C为浸提液中氨氮的含量（mg/L）；V为浸提液的体积（mL）；A为吸收氨气的海绵的有效面积（m2）；t为采样时间（h）。

1.2.2.3 硫化氢发量的测定方法 硫化氢气体采用静态箱法测定参考袁玉玲的方法改进［15］。静态箱高14 cm，宽24 cm，长38 cm，在不扰动堆体表面状态下罩于堆体上，箱体与堆体用堆料密封。在采样箱的顶部上设采气口，放置2 h后利用便携式硫化氢探测器检测气体。通过如下公式计算硫化氢挥发量：

式中，f为硫化氢排放量［mg/（m2·h）］；C为静态箱中硫化氢的浓度（mg/m3）；V为静态箱的体积（m3）；A为静态箱与堆体接触的有效面积（m2）；t为采样时间（h）。

1.2.2.4 堆肥中微生物群落代谢检测及数据分析 取堆肥样品5 g，加45 mL无菌生理盐水，160 r/min下振荡1 h，静置后取上清液用无菌生理盐水稀释，稀释浓度为10-3，将稀释后的上清液接种于Biolog ECO板中，每孔150 μL，每个样品3次重复，28℃培养，每24 h在Biolog读书仪上读取吸光度，连续测定120 h。

1.2.2.5 平均吸光度变化曲线（average well color development，AWCD） 对Biolog测得的吸光度数据进行平均吸光度变化计算，即：AWCD=∑（C-R）/31，其中C为每个孔的吸光度值，R为对应孔的吸光度值［16］。

1.2.2.6 多样性指数计算 采用培养96 h的数据计算微生物群落的多样性指数。Shannon指数（H′）用于评估丰富度，H′ =-∑（Pi×lnPi）；式中Pi为有底物的孔和对照孔的光密度值差与整板总差的比 值， 即 Pi=（Ci-R）/∑（Ci-R）。Simpson指 数（D）又称优势度指数，是多样性方面的集中性度量，D=1-∑（Pi×Pi）；其中Pi为第i孔的相对吸光值与整个平板相对吸光值总和的比率［17］。

1.2.3 数据处理 数据用Excel 2010软件进行数据统计、制图，采用 SPSS 21.0软件进行数据分析。

2 结果

2.1 不同处理堆肥过程中温度、pH、含水率的动态变化

由图1可知，不同处理的堆体温度变化趋势各异。各处理堆体升温速度差异较大，5%处理和10%处理升温速度比CK处理和15%处理快。5%处理和10%处理在堆肥的第5天和第6天进入高温期（＞50℃），CK处理和15%处理在第9天和11天进入高温期。5%处理的高温持续时间最长，为25 d，其次为10%处理，持续时间为23 d；CK处理和15%处理分别为20 d和12 d。综上所述，从升温和高温持续时间考虑，牛粪初始含水率在58%左右时，添加5%的腐殖酸煤堆肥效果最佳。

图1 不同处理堆体温度动态变化Fig.1 Dynamic variations in temperature under different compost treatments

堆料pH值的动态变化如图2所示，不同处理的pH值变化趋势基本一致，都是先上升后下降，堆肥10 d-30 d，各处理堆料pH值达到最大。堆肥结束时，各理堆料pH值降到9以下，CK处理最高，为8.95；15%处理pH值最低，为8.42。

图2 不同处理的堆料pH值动态变化Fig.2 Dynamic variations in pH value under different compost treatments

堆料含水率的动态变化如图3所示，不同处理的含水率变化趋势基本一致，都是逐渐下降，堆肥第10天后，各处理堆料含水率下降速度加快。堆肥结束时，各处理堆料含水率在5%处理最低，为39.05%；15%处理下含水率最高，为41.9%。

图3 不同处理的堆料含水率动态变化Fig.3 Dynamic variations in moisture content under different compost treatments

2.2 不同处理种子发芽指数动态变化

由图4可知，在堆肥0-10 d，15%处理的GI值升高速度最快，10%处理次之，5%处理最慢，CK处理的GI值有所降低。堆肥30 d后，各处理堆料的GI值升高速度加快，15%和10%处理的GI值始终大于CK处理和5%处理。堆肥结束时，加入腐殖酸处理的GI值均大于80%，添加腐殖酸煤处理比CK处理的GI值高6.53%-13.06%。

图4 不同处理种子发芽指数动态变化Fig.4 Dynamic variations in germination index（GI）of seeds under different compost treatments

2.3 不同处理C/N比的动态变化

由图5可知，随着堆肥的进行，各处理堆料的C/N呈降低的趋势，各处理堆料C/N在堆肥第20天后下降速度减慢。堆肥结束时，加入腐殖酸煤处理堆料的C/N均高于CK处理，并且C/N随腐殖酸煤加入量的升高而升高。CK处理和5%处理的C/N小于20，分别为17.03和18.55。

图5 不同处理C/N动态变化Fig.5 Dynamic variations in C/N under different compost treatments

2.4 堆料表面H2S和氨气浓度的动态变化

从图6可以看出，随着堆肥时间的延长，各处理堆料表面的H2S浓度呈先上升后下降的趋势。堆肥过程中，加入腐殖酸煤处理的堆料表面H2S浓度明显低于未加腐殖酸煤的CK处理。各处理H2S释放浓度的峰值出现时间均在第20天，CK处理最 高 为 2.05 mg/（m2·h），5% 处 理、10% 处 理、15% 处 理 的 峰 值 分 别 为 1.65 mg/（m2·h）、1.42 mg/（m2·h）、1.36 mg/（m2·h）。堆肥过程中 CK 处理的H2S平均释放浓度最高为1.5 mg/（m2·h），添加腐殖酸煤处理的H2S平均释放浓度比CK处理低25.17%-45.21%，可见，加入腐殖酸煤可有效降低牛粪堆肥过程中H2S的释放量。

图6 堆料表面H2S浓度的动态变化Fig.6 Dynamic variations in hydrogen sulfide concentration under different compost treatments

从图7可以看出，随着堆肥时间的延长，各处理堆料表面的NH3浓度呈先上升后下降的趋势。堆肥过程中，加入腐殖酸煤处理堆料表面的NH3浓度明显低于未加腐殖酸煤的CK处理。各处理NH3释放量的峰值出现时间相同，都在第20天，但是峰值的大小不同，CK处理、5%处理、10%处理、15%处理的峰值分别为 32.32 mg/（m2·h）、23.24 mg/（m2·h）、19.27 mg/（m2·h）、15.94 mg/（m2·h）。CK处理、5%处理、10%处理、15%处理的NH3平 均 释 放 浓 度 分 别 为 18.5 mg/（m2·h）、14.64 mg/（m2·h）、12.5 mg/（m2·h）、11.14 mg/（m2·h），加入腐殖酸煤处理的NH3浓度比未加腐殖酸煤的CK处理低20.81%-39.74%。可见，加入腐殖酸煤可有效降低牛粪堆肥过程中NH3的释放量。

图7 堆料表面NH3浓度的动态变化Fig.7 Dynamic variations in ammonia concentration under different compost treatments

2.5 添加腐殖酸煤对堆肥中微生物群落代谢活性的影响

由图8中可以看出，添加腐殖酸处理在各阶段的AWCD值明显高于CK处理。这说明添加腐殖酸后，微生物平均活性显著增加，并随着堆肥时间的增加微生物平均活性不断升高，高温期的AWCD值增加速度高于堆肥其他时期，表明此阶段微生物繁殖迅速，生理代谢旺盛；进入降温期后，微生物活性增加速度开始下降。当腐殖酸煤添加量高于10%时，AWCD值开始下降；腐殖酸煤添加量在0-10%时，AWCD值随腐殖酸煤的添加量增加而升高，添加腐殖酸煤处理的平均AWCD值比CK处理高22.27%-28.47%，由此可知，适当的添加腐殖酸煤可以提高堆肥微生物的代谢活性，促进堆肥腐熟进程。

图8 堆料AWCD值的动态变化Fig.8 Dynamic variations in AWCD under different compost treatments

2.6 添加腐殖酸煤对堆肥中微生物群落多样性的影响

发酵不同时期Shannon指数、Simpson指数如图9、图10所示，添加腐殖酸煤明显增加了堆肥过程中的微生物多样性，在堆肥不同阶段微生物群种类增加，演替频繁，不同的微生物种类进行不同物质的转化代谢，从而促进了堆肥腐熟进程。当腐殖酸煤添加量高于10%时，Shannon指数、Simpson指数开始下降，腐殖酸煤添加量在0-10%时，Shannon指数、Simpson指数随腐殖酸煤的添加量增加而升高，添加腐殖酸煤处理的平均Shannon指数、Simpson指数比CK处理分别高2.32%-6.06%和23.21%-30.48%，由此可知，适当的添加腐殖酸煤可以提高堆肥微生物的多样性，促进堆肥腐熟进程。

图9 堆料Simpson指数的动态变化Fig.9 Dynamic variations in Simpson index under different compost treatments

图10 堆料Shannon指数的动态变化Fig.10 Dynamic variationsin Shannon index under different compost treatments

3 讨论

畜禽粪便和作物秸秆堆肥的过程中，铵态氮会转变为氨气挥发，造成超过65%的氮损失［18-19］。堆肥过程中氮素损失既减少了有机肥的肥效，又污染了环境。因此，农业废弃物堆肥过程中如何减少氮素损失，提高肥料质量，减少环境污染一直是研究者们非常关注的问题［20］。影响堆肥过程中氮素损失的主要因素包括：C/N、pH值、温度、水分、通风量等。畜禽粪便中的氮含量较高（C/N较低），容重较大，需要与一些碳含量较高、容重较小的废弃物（如秸秆、木屑、谷壳等）配合，来调节其C/N比和容重，可以减少由于氮含量过高或者通气不良（反硝化作用）造成的氮素损失［21］。蘑菇渣和牛粪的联合堆肥时，添加10%的风化煤可以加快腐熟进程，提高堆体升温速度和有机物料的腐解速度［10］，与本研究获得的结果相似。李荣华等［22］研究表明添加风化煤有利于猪粪堆肥的腐殖化过程进行。薛梅［23］研究发现将羊粪和风化煤、废弃甜高梁稻杆结合作为堆肥主要原料，不仅可以减少环境污染，还可产生质优价廉的有机肥料。添加可利用形态的碳，可以促进微生物更迅速地利用NH4+，减少NH3的挥发损失［24］。研究表明添加木炭能促进堆肥有机物料的降解，加快堆肥腐熟脱毒，增加堆肥产品总氮的质量分数，提高产品质量，减少堆肥初期氨气的挥发［25］。有学者发现加土和炉渣可以降低堆肥高温期水溶性氨氮的浓度，减少氨气的排放，有利于后期硝态氮和有机氮的形成，从而降低堆肥中氮素的损失［26］。秦莉等［27］研究表明，堆肥过程中氨气累积释放量随堆料C/N比的升高依次降低。本研究获得的结果与以上研究相似，氨气和硫化氢的释放量随腐殖酸煤添加量的升高而降低，添加量为15%时，氨气和硫化氢的释放量最低。

堆体温度是评判堆肥腐熟程度的重要因素［28］。本研究中各处理的高温持续时间分别为5%处理25 d、10%处理23 d、CK处理20 d、15%处理12 d，均达到了畜禽粪便无害化卫生要求［29］。pH值是堆肥腐熟的又一重要指标，影响堆体内微生物的生长繁殖。从pH值变化趋势可以推断，添加腐殖酸煤可以抑制堆料酸碱度的升高，由于微生物氨化作用减弱，硝化作用增强，导致堆肥后期pH值下降。适合微生物生存的pH在6.70-9.00之间，过酸或过碱的都会对微生物的生长繁殖产生影响。本研究中腐殖酸煤添加，降低了牛粪的酸碱度，促进了堆肥腐熟进程。研究不同时期堆料的种子发芽指数（GI），不仅可以检测堆料的植物毒性，而且获得堆料植物毒性随着堆肥腐熟进程的动态变化［30］。研究表明，GI是反映堆肥腐熟度的可靠指标，GI大于80%的堆肥产品可以确定为完全腐熟［31］。本研究中添加腐殖酸煤的处理，堆肥结束时的GI均大于80%，且GI随腐殖酸添加量的升高而升高，说明鲜牛粪添加适量的腐殖酸煤可以提高堆肥产品的腐熟度。堆肥过程中，随着堆体质量损失和微生物降解作用，堆料总有机碳逐渐减小，使堆料C/N降低［32］。堆肥结束时，CK和 5%处理的碳氮比分别为17.03和18.55，低于20，符合堆肥腐熟度的要求［33］。10%和15%处理的碳氮比分别为20.96和22.01，高于20，究其原因可能是腐殖酸煤的加入量超过了堆肥过程中总有机碳的减少量，使C/N升高。因此在鲜牛粪堆肥过程中，腐殖酸煤的最佳加入量在5%-10%之间。

研究堆肥腐熟过程中微生物种群组成、数量以及相互之间关系，有助于了解堆肥腐熟过程中物质转化及保氮技术。堆肥过程中微生物的生长环境比较复杂，传统的分离培养技术最多能鉴定10%左右的微生物种类［34］。Biolog 微平板技术可以通过检测微生物群落的碳代谢来评估环境样品的微生物代谢情况［35］。Biolog ECO板有31种碳源和一个空白对照，共96孔。当微生物利用孔中的碳源进行呼吸代谢时，孔中的四唑紫染料会进行还原反应，孔的颜色发生变化。Biolog ECO板技术操作简便、灵敏度高，且可最大限度地保留微生物群落原有的代谢特征，常用于环境微生物活性和功能多样性的研究［36］。AWCD值也称为微生物群落代谢剖面，其表示微生物的平均活性，能直观地体现微生物群落反应速度和最终达到的程度［37］。Biolog ECO研究中，计算多样性指数能够从不同侧面反映微生物群落代谢功能的多样性［38］。蔡涵冰等［39］研究发现不同好氧堆肥时期具有不同的微生物群落多样性。本研究中添加腐殖酸煤处理的AWCD值、香农指数、辛普森指数均有所升高，因此推断适量添加腐殖酸煤可增加了堆肥过程中的微生物多样性，在堆肥不同阶段微生物群种类增加，演替频繁，不同的微生物种类进行不同物质的转化代谢，从而促进了堆肥腐熟进程。

4 结论

鲜牛粪堆肥过程中添加5%-10%的腐殖酸煤，可提高堆肥微生物的多样性指数以及堆肥产品的种子发芽指数，降低NH3和H2S释放量20.82%-39.74%和25.17%-45.21%。添加适量的腐殖酸煤可以促进堆肥微生物种群演替，加快对不同物质的转化代谢，促进堆肥腐熟进程，提高堆肥产品质量。