七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠肠道微生物及酶活性的影响

谢果珍 唐圆 吴仪 黄莉莉 谭周进

（湖南中医药大学，长沙 410208）

肠道微生物是肠道微生态的重要组成部分，据统计，哺乳动物肠道中栖息着种类超过1 000种，数量超过40万亿的微生物［1］。肠道微生物可产生各种代谢酶参与代谢机体所摄入的食物及药物，并生成营养物质和生物活性成分影响人体健康，被视为机体不可或缺的“代谢器官”［2］。研究表明，药物与肠道微生物间存在复杂的相互作用：一方面，药物进入体内会影响肠道微生物的组成及功能，进而导致酶的数量及活性发生改变；另一方面，肠道微生物与酶参与药物的代谢，影响药物的疗效与副作用［3-4］。因此，越来越多的研究者认为肠道微生物可能是药物的作用靶点［5-7］。研究药物对肠道微生物及酶的影响有助于从肠道微生态角度评价药物的疗效及探明药物的作用机理。

七味白术散出自北宋钱乙所著的《小儿药证直诀》，主治脾虚泄泻，在现代临床上亦常用于治疗多种原因所致的腹泻［8］。中药的疗效是多成分、多靶点、多途径共同作用的结果。课题组前期从肠道微生物及肠道酶活性等角度研究了七味白术散对菌群失调腹泻小鼠的影响，发现七味白术散可促进乳酸菌（Lactobacilli）、酵母菌（Saccharomyces）和双歧杆菌（Bifidobacterium）等有益菌的增殖，抑制艰难梭菌（Clostridium difficile）等致病菌和大肠杆菌（Escherichia coli）等条件致病菌的生长，另外提高了淀粉酶、蔗糖酶、纤维素酶及乳糖酶的活性，降低了木聚糖酶及蛋白酶的活性，对肠道微生态有较好的调节作用［9-11］。然而七味白术散治疗腹泻的物质基础尚不明确。

在临床上七味白术散以口服为主，其水煎液的主要成分为极性较大的苷类及多糖类。苷类化合物是中药重要的活性成分之一，在心血管系统、呼吸系统、消化系统、神经系统、免疫系统等表现出广泛的药理活性。研究显示葛根素改善腹泻型肠易激综合征［12］、人参皂苷改善非酒精性脂肪肝［13］、黄芩苷改善结肠炎［14］及肉苁蓉总苷抗抑郁［15］的作用与调节肠道菌群、恢复肠道稳态有关。现有研究多提取单味中药的苷类成分进行药效药理研究，而对中药复方总苷类成分的研究较少。为进一步揭示七味白术散治疗腹泻的物质基础，本研究从七味白术散中提取分离得到总苷类成分，探究七味白术散总苷对肠道微生物及酶活性的影响，以期为七味白术散治疗菌群失调腹泻的物质基础及作用机理提供佐证，为从肠道微生态角度评价中药复方的有效物质提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 202-2AB型电热恒温干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），都市主妇全能小钢磨（永康市铂欧五金制品有限公司），RE-2000B旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器有限公司），KQ5200DE超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司），SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（上海亚荣生化仪器有限公司），HA-600三用恒温水箱（金坛市神科仪器厂），FD5-3真空冷冻干燥机（金西盟（北京）仪器有限公司），Nano-drop 2000/2000C紫外分光光度计（赛默飞世尔科技有限公司），高速冷冻离心机1850R（湖南湘仪仪器有限公司），恒温摇床培养箱（金坛荣华仪器制造有限公司），电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。

1.1.2 药材与试剂 土炒白术（湖南，批号：20201014）、人参（东北，批号：20200610）、木香（云南，批号：20201011）、甘草（内蒙古，批号：20200610）、广藿香（广东，批号：20200816）、葛根（湖南，批号：20201020）、茯苓（湖南，批号：20201109）购于湖南省弘华中药饮片有限公司，经湖南中医药大学潘清平教授鉴定为正品。

头孢拉定胶囊（06200502，通化万通药业股份有限公司），硫酸庆大霉素注射液（01Y07011A2，宜昌人福药业）。无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司，荧光素二乙酸（fluorescein diacetate，FDA）、邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG），购于上海源叶生物科技有限公司。

1.1.3 实验动物 无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雄性昆明（KM）小鼠30只，体重为（20±2）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司［SCXK（湘）2019-0004］。小鼠购回后于室温20-22℃，相对湿度50%-70%环境下分笼饲养，自由取食及饮水。小鼠普通维持饲料由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。本研究通过湖南中医药大学动物实验福利伦理审查（LL2020071001）。

1.2 方法

1.2.1 七味白术散水煎液的制备 按七味白术散处方用量［16］称取各药饮片，加10倍量蒸馏水浸泡30 min，武火煮沸后小火煎煮30 min，纱布过滤，煎煮2次，合并水煎液，浓缩至生药浓度为0.34 g/mL，4℃保存备用。

1.2.2 七味白术散总苷的制备 七味白术散总苷按课题组优化的提取工艺制备，即按比例称取七味白术散各味药粉碎后过60目筛的粉末，加14倍量的蒸馏水，煎煮2次，每次煎煮53 min，合并水煎液，浓缩至一定体积后加无水乙醇，使乙醇终浓度为75%，搅拌均匀后4℃静置过夜。乙醇提取液浓缩后依次用石油醚脱脂3次，水饱和正丁醇萃取3次。正丁醇萃取液减压浓缩至一定体积后水浴蒸干，再冷冻干燥后得到七味白术散总苷粉末。七味白术散总苷的提取率为1.48%。

七味白术散总苷提取率（%）=七味白术散总苷粉末量（g）/七味白术散全方粉末量（g）× 100%。

1.2.3 FDA的制备 称取6 mg FDA，加3 mL丙酮，制得2 mg/mL的FDA储备液，置于棕色瓶中避光保存［17］。

1.2.4 动物分组及造模 小鼠适应性饲养3 d后随机分成正常组（5只，N）和模型组（25只）。模型组小鼠灌胃混合抗生素，即取6支硫酸庆大霉素注射液（2 mL/支）及3粒头孢拉定胶囊（0.25 g/粒），配成浓度为62.5 g/L的抗生素混合液，0.4 mL/只/次，每天2次，共5 d，模型组小鼠粪便变得稀湿，即为造模成功。正常组小鼠给予等体积无菌水［11］。

1.2.5 给药 造模成功后将模型组小鼠随机分为自然恢复组（R）、七味白术散水煎液组（TW）、七味白术散总苷低剂量组（TL）、七味白术散总苷中剂量组（TM）、七味白术散总苷高剂量组（TH），每组各5只。治疗期间正常组及自然恢复组小鼠灌胃无菌水，其余各组分别给予七味白术散水煎液及低、中、高剂量七味白术散总苷。根据临床等效剂量换算，七味白术散水煎液的给药剂量为9.945 g/kg/d，七味白术散水煎液给药剂量乘以提取率的1、2、4倍量分别为七味白术散总苷低（147.2 mg/kg/d）、中（294.4 mg/kg/d）、高剂量（588.8 mg/kg/d），灌胃量为 0.4 mL/只/次，每天2次，连续给药3 d。

1.2.6 检测指标

1.2.6.1 摄食量、体重及脏器指数测定 观察小鼠粪便及一般行为状态，分不同阶段记录小鼠的摄食量。分别在小鼠购回当天、适应期结束、造模期结束、治疗期结束称取每只小鼠的体重，在小鼠处死解剖后取出脾脏、胸腺及肝脏，滤纸吸干血液后称重，计算脾脏指数、胸腺指数及肝脏指数等脏器指数。脏器指数（%）= 脏器重量（g）/小鼠体重（g）×100%。

1.2.6.2 肠道微生物培养 治疗结束后颈椎脱臼处死小鼠，无菌环境下收集小鼠肠道内容物，同组样品混匀后放入装有无菌水及玻璃珠的锥形瓶中，120 r/min震荡30 min后涂布平板后培养计数。细菌总数用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，大肠杆菌用伊红美蓝琼脂（Eosin methylene blue，EMB）培养基，双歧杆菌用BBL琼脂培养基；乳酸菌用MRS琼脂培养基。采用混菌法计数，每个稀释度做3次重复，计算每克肠道内容物所含的菌数［9］。

1.2.6.3 肠道微生物活度测定 取材方法同1.3.2。吸取2.5 mL FDA储备液加入pH 7.6已灭菌的磷酸缓冲液中（A液），取干燥无菌试管，加入2 mL A液、50 μL待测液置于24℃摇床反应90 min后加2 mL丙酮终止反应。空白对照为2 mL A液中依次加入50 μL待测液及2 mL丙酮，24℃摇床反应90 min取出。在490 nm下测定吸光值，每个样品平行测定3次，以A490值表示单位质量样品的微生物活度［17］。

1.2.6.4 肠道酶活性测定 取材方法同1.3.2。将各组小鼠肠道内容物样品分别放入装有无菌水及玻璃珠的离心管中，震荡2 min后3 000 r/min离心10 min，取上清液。乳糖酶活性测定用ONPG法，蔗糖酶活性测定用DNS比色法［10-11］。

1.2.7 统计学分析 采用SPSS 21.0软件对实验数据进行统计学分析，结果用平均值 ± 标准差（±s）表示。用独立样本t检验进行差异显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠粪便及摄食量的影响

正常组小鼠的粪便为黑色，圆柱状，按压后不黏手。混合抗生素灌胃后小鼠排便次数明显增多，粪便为黄色、稀湿、松软，按压后黏手，能看见未完全消化的食物。经治疗后七味白术散水煎液组小鼠的粪便逐渐好转，治疗3 d后接近正常粪便。不同剂量七味白术散总苷组的小鼠粪便由黄转黑，但粪便仍较稀湿。各组小鼠的精神状态在造模及治疗期间无明显差异。混合抗生素使小鼠的摄食量减少，而七味白术散水煎液及不同剂量的七味白术散总苷可使菌群失调腹泻小鼠的摄食量恢复（图1）。

图1 七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠摄食量的影响Fig. 1 Effects of total glycosides of QWBZP on the food intake of mice with dysbacteria-diarrhea

2.2 七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠体重的影响

体重是评价机体生长发育与健康情况的直观指标。从表1可知各组小鼠的初始体重及适应期增重率较接近，造模期间混合抗生素使小鼠的增重率降低，但与正常组相比无显著差异，说明混合抗生素抑制了小鼠体重增长。在治疗期间，自然恢复组小鼠的增重率高于正常组，差异极显著（P＜0.01），其余各组小鼠的增重率与正常组相比提高，但无显著差异，说明七味白术散水煎液及总苷有利于体重的恢复。

表1 七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠体重的影响Table 1 Effects of total glycosides of QWBZP on the body weight of mice with dysbacteria-diarrhea（n = 5）

2.3 七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠脏器指数的影响

与正常组相比，其他各组小鼠的脾脏指数有不同程度的提高，且高剂量组小鼠的脾脏指数与正常组小鼠差异显著（P＜0.01）。经过3 d治疗，水煎液组及中剂量总苷组小鼠的脾脏指数逐渐回到正常水平。与自然恢复组相比，低、高剂量的七味白术散总苷组小鼠的脾脏指数增加，中剂量的七味白术散总苷组小鼠的脾脏指数降低，但差异不显著。各组小鼠的胸腺指数及肝脏指数均无显著差异（表2）。

表2 七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠脏器指数的影响Table 2 Effects of total glycosides of QWBZP on the visceral index of mice with dysbacteria-diarrhea（n = 5）

2.4 七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠肠道微生物的影响

从表3可知，混合抗生素增加了小鼠肠道细菌（P＜0.01）及大肠杆菌（P＜0.05）的数量，降低了双歧杆菌及乳酸菌的数量（P＜0.05）。七味白术散水煎液显著降低了菌群失调腹泻小鼠肠道中细菌及大肠杆菌的数量（P＜0.05），同时提高了双歧杆菌及乳酸菌的数量，但无显著差异。低剂量的七味白术散总苷提高了菌群失调腹泻小鼠大肠杆菌（P＜0.01）、双歧杆菌（P＜0.01）及乳酸菌（P＜0.05）的数量，降低了细菌的数量（P＜0.01）；中剂量的七味白术散总苷提高了菌群失调腹泻小鼠细菌、大肠杆菌及乳酸菌的数量，差异极显著（P＜0.01）；高剂量的七味白术散总苷显著提高了菌群失调腹泻小鼠大肠杆菌（P＜0.05）及乳酸菌（P＜0.01）的数量。总体而言，不同剂量的七味白术散总苷均提高了菌群失调腹泻小鼠大肠杆菌、双歧杆菌及乳酸菌的数量，但作用强度不一，低剂量七味白术散总苷对双歧杆菌及乳酸菌的增殖效果显著。

表3 七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠肠道微生物的影响Table 3 Effects of total glycosides of QWBZP on the intestinal microbiota of mice with dysbacteria-diarrhea（n = 3）

2.5 七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠肠道微生物活度的影响

从图2可知，混合抗生素使小鼠肠道微生物活度极显著下降，经3 d的自然恢复仍未回到正常水平（P＜0.01）。七味白术散水煎液及不同剂量的七味白术散总苷均可提高菌群失调腹泻小鼠的肠道微生物活度（P＜0.01或P＜0.05）。经过3 d的治疗，低剂量组小鼠的肠道微生物活度与正常组接近。总体而言，不同剂量的七味白术散总苷可提高菌群失调腹泻小鼠的肠道微生物活度，且表现出一定的剂量效应。

图2 七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠肠道微生物活度的影响Fig. 2 Effects of total glycosides of QWBZP on the intestinal microbial activities of mice with dysbacteriadiarrhea（n=3）

2.6 七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠肠道乳糖酶活性的影响

与正常组相比，混合抗生素大大降低了小鼠肠道乳糖酶的活性（P＜0.01）。经过3 d的治疗，七味白术散水煎液及总苷极显著提高了菌群失调腹泻小鼠肠道乳糖酶活性（P＜0.01），且高于正常组（P＜0.01）。七味白术散总苷对乳糖酶活性的影响表现出一定的剂量效应（图3）。

图3 七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠肠道乳糖酶活性的影响Fig. 3 Effects of total glycosides of QWBZP on the lactase activities of mice with dysbacteria-diarrhea（n=3）

2.7 七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠肠道蔗糖酶活性的影响

抗生素及七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠肠道蔗糖酶活性的影响与乳糖酶相似，混合抗生素显著降低了小鼠肠道蔗糖酶的活性（P＜0.05），七味白术散水煎液及总苷均提高了菌群失调腹泻小鼠肠道蔗糖酶活性（P＜0.01或P＜0.05）。低、中剂量的七味白术散总苷对蔗糖酶的作用强度与七味白术散水煎液接近，而高剂量的七味白术散总苷使蔗糖酶活性更趋于正常组（图4）。

图4 七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠肠道蔗糖酶活性的影响Fig.4 Effects of total glycosides of QWBZP on the sucrase activities of mice with dysbacteria-diarrhea（n=3）

3 讨论

在正常状态下，机体的肠道微生物保持着动态平衡，共同参与机体的代谢及免疫。肠道微生态失衡是疾病的主要触发因素，中药复方可将肠道微生态从病理状态调至生理状态而发挥疗效。课题组前期的研究显示了七味白术散通过对肠道微生物的促抑作用使肠道微生态恢复平衡而治疗菌群失调腹泻，但其调节肠道微生态的物质基础尚不明确。本研究以七味白术散水煎液为参照，探讨了七味白术散总苷成分对肠道微生态的调节作用。通过传统的微生物培养技术发现七味白术散总苷可促进菌群失调腹泻小鼠肠道中双歧杆菌及乳酸菌增殖，且效果优于七味白术散水煎液。同时，七味白术散总苷还提高了菌群失调腹泻小鼠肠道中大肠杆菌的数量，与七味白术散水煎液的作用趋势相反。双歧杆菌与乳酸菌被认为是有益菌，二者可通过抑制致病菌感染，改善肠黏膜屏障，抑制促炎因子产生，改变树突细胞功能等途径调节肠道稳态［18］。大肠杆菌为条件性致病菌，与腹泻、炎症有关［9］。结果表明苷类成分是七味白术散复方调节双歧杆菌及乳酸菌的主要成分，低剂量的七味白术散总苷可更好促进有益菌的增殖，而总苷类成分促进大肠杆菌的增殖可能是其改善粪便含水量方面不及七味白术散水煎液的原因。然而，肠道环境中微生物的变化十分复杂，体外培养仅能反映肠道微生物变化的冰山一角，仍需利用高通量测序技术进一步研究七味白术散总苷对菌群失调腹泻小鼠肠道微生态的影响。

FDA可被存在于细菌及真菌中的酯酶、蛋白酶、脂肪酶等非专一性酶催化水解产生荧光素，且FDA水解酶活性与微生物活性成正比［19］。以往研究多用于评价土壤微生物活性及土壤质量。考虑到肠道菌群亦可分泌大量的水解酶，从而实现FDA的高效水解，而水解是肠道微生物代谢食物和药物的主要途径，FDA水解酶活性在一定程度可反映肠道微生物的代谢能力，因此本课题组将FDA水解法应用肠道微生物，以反映肠道微生物活性及功能的变化［17，20］。研究结果显示不同处理对小鼠肠道微生物活度、乳糖酶及蔗糖酶活性的影响高度一致，可进一步证明用FDA水解法评价动物或人体肠道微生物活度及功能具有可靠性。在本研究中，七味白术散水煎液及总苷都可提高菌群失调腹泻小鼠肠道的微生物活度，且不同剂量的七味白术散总苷表现出一定的剂量效应，低剂量的七味白术散总苷对肠道微生物活度的影响与水煎液相当，接近正常水平。提高菌群失调腹泻小鼠的肠道微生物活度，增强肠道微生物的代谢能力，是七味白术散减轻腹泻的机制之一。苷类化合物的极性大，生物利用度低，大多需要进入肠道后被糖苷水解酶水解为次级苷或苷元才发挥药效［4］。因此，肠道微生物活度及水解酶活性的提高，也有利于七味白术散总苷的代谢，释放出真正的药效成分。结合七味白术散总苷在菌群失调小鼠体内的转化情况，建立药物与肠道微生物的互作网络，将更有利于阐述七味白术散治疗菌群失调腹泻的机制。

乳糖酶及蔗糖酶是存在于小肠壁刷状边缘的双糖酶，可将膳食中的双糖分解为单糖，与腹泻密切相关。如乳糖酶及蔗糖酶缺乏会导致过量的碳水化合物在小肠堆积，增加肠道渗透负荷，导致肠腔液增加，引发渗透性腹泻。而过量的发酵产物使得肠内气压增高，小肠膨胀导致腹胀和腹痛［21］。研究还发现双糖酶水平与炎症呈负相关，因此双糖酶缺乏还多与炎症性肠病、腹腔疾病、淋巴细胞性结肠炎等胃肠道疾病共存［22］。课题组前期发现七味白术散治疗菌群失调腹泻与乳糖酶及蔗糖酶活性的提高有关。本研究发现不同剂量的七味白术散总苷均可使菌群失调腹泻小鼠肠道乳糖酶及蔗糖酶活性提高，与全方对菌群失调腹泻小鼠肠道乳糖酶及蔗糖酶活性的影响趋势一致，苷类成分是七味白术散调节肠道微生态、治疗菌群失调腹泻的重要药效成分。

4 结论

七味白术散总苷可促进双歧杆菌及乳酸菌的增殖，提高肠道微生物活度及乳糖酶、蔗糖酶的活性，作用趋势与七味白术散水煎液一致，但程度有异。肠道微生态为揭示苷类成分在七味白术散治疗菌群失调腹泻中的作用提供了有力证据，可作为评价中药复方有效物质的切入点之一。