表达非洲猪瘟病毒CD2v与P12蛋白的重组伪狂犬病毒的构建

梁旺旺 李成龙 陈文智 丰志华 蔡少丽 陈骐

（福建省天然免疫生物学重点实验室 福建师范大学南方生物医学研究中心，福州 350117）

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染家猪及野猪引起的一种急性、出血性、烈性传染病［1］。该病于1921年在肯尼亚首次报道，迄今已成为全球性猪养殖业难题，其致死率约为100%［2］。2018年8月，我国辽宁省沈阳市出现首例国内非洲猪瘟病例，至今疫情已扩散至全国［3］。

ASFV为双链DNA病毒，病毒颗粒直径约200 nm，具有多层结构，由类核、核壳、内包膜、衣壳和宿主衍生的外包膜组成［4］。根据毒株的不同，基因组大小介于170-190 kb之间，含约150个开放阅读框（ORFs），至少可编码54个结构蛋白和100多个非结构蛋白［5］。ASFV CD2v与宿主的CD2结构与功能类似，主要参与ASFV的免疫逃逸，以及感染细胞后对红细胞的吸附［6］。在弱毒活疫苗研发过程中CD2v通常被删除，研究表明缺失CD2v后的毒株接种家猪后无明显临床感染症状，可以保护强毒攻击［7］。与CD2v不同，P12位于外囊膜及内囊膜上，目前P12被认为是ASFV与宿主细胞结合的配体，用重组P12蛋白孵育细胞后体外感染被阻断，且针对P12的抗体被证明阻碍了病毒与宿主细胞的结合，但并不能完全抑制病毒结合或中和病毒感染，因此它不是导致病毒对细胞结合的唯一配体［8］。CD2v与P12通常被用作DNA疫苗、亚单位疫苗和病毒载体疫苗的研发，研究表明将CD2v与P12蛋白通过哺乳动物细胞和杆状病毒载体表达系统表达后制成亚单位疫苗，或将CD2v与P12制成DNA疫苗或病毒载体疫苗对猪进行接种，可检测到体液免疫反应和细胞免疫反应［9-11］。但目前并无商业化疫苗用于预防ASF，其疫苗的研发需要更多的探索。

伪狂犬病也称奥耶斯基氏病（Aujeszky’s disease），由伪狂犬病毒感染引起，给世界猪养殖业造成了巨大的经济损失。伪狂犬病毒（PRV）属于疱疹病毒科，α疱疹病毒亚科水痘病毒属［12］。其基因组为约145 kb的双链DNA，呈现圆形的完整病毒颗粒直径在150-180 nm之间，核衣壳直径约为110 nm［13］。其基因组中含有大量复制非必须基因，如TK、gI与gE等，这些基因通常可被外源基因取代，从而构建活病毒载体疫苗［14-15］。该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了TK及gI缺失且重组表达ASFV CD2v与P12的重组弱毒株PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v），我们对该重组毒株遗传稳定性及安全性进行了评估，为将来研发预防非洲猪瘟及伪狂犬多价疫苗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒细胞毒株动物 pX459质粒购自Addgene，大肠杆菌（E. coli Trans 5α）购自北京全式金生物技术有限公司；PRV-Fa经典病毒株由福建省农业科学院提供；同源重组质粒pcDNA3.1-PRV-TKCD2v与pcDNA3.1-PRV-gI-P12由武汉金开瑞生物工程有限公司合成；人胚肾上皮细胞（HEK293T）与非洲绿猴肾上皮细胞（Vero）均购自ATCC（American Type Culture Collection）；ICR（Institute of Cancer Research）小鼠购自吴氏实验动物贸易有限公司。

1.1.2 主要试剂与仪器 2 × Phanta Max Master Mix聚合酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Lipofectamiane 2000 转染试剂购自美国Life Techology；鼠源His（组氨酸）单克隆抗体与鼠源FLAG单克隆抗体购自北京全式金生物技术有限公司；羊抗鼠IgG购自英国Abcam；800 CW donkey anti-mouse Ab购自武汉三鹰生物技术有限公司；Gbico胎牛血清购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；Opti MEM 培养基购自Life Techology。

所用的仪器包括PCR仪 2720型（美国ABI公司）；NanoDrop 微量分光光度计（赛默飞世尔科技公司）；Bio-Red凝胶成像系统（伯乐生命医学产品有限公司）；双色红外激光成像仪（美国LI-COR公司）；槽式蛋白转膜仪（美国Hoefer公司）；激光共聚焦显微镜（德国蔡司公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 通过https：//zlab.bio/guidedesign-resources网站设计针对PRV病毒TK及gI基因的sgRNA序列（见表1），由浙江尚亚生物合成。

表1 靶向CD2v与p12基因的sgRNA序列Table 1 sgRNA sequences targetting CD2v and p12 gene

1.2.2 表达非洲猪瘟病毒CD2v和P12的重组伪狂犬病毒的构建

1.2.2.1 敲除载体的构建 将sgRNA退火，把退火产物与BpiI酶切后的pX459质粒连接，转化至大肠杆菌中，提取质粒进行扩增，获得敲除载体。

1.2.2.2 重组载体pcDNA3.1-PRV-TK-CD2v与pc-DNA3.1-PRV-gI-p12的合成 从NCBI获取CD2v基因与p12基因序列，在CD2v基因序列前分别加入 EF1α（elongation actor 1 alpha） 启 动 子，CMV（Cytomegalovirus）增强子，CMV启动子和绿色荧光蛋白（EGFP）序列；在p12基因序列前分别加入EF1α启动子，CMV增强子，CMV启动子和能表达红色的mCherry蛋白序列，并通过武汉金开瑞生物工程有限公司分别合成在pcDNA3.1质粒上，酶切位点分别为EcoR V，BamH I；EcoR V，Hind III。

1.2.2.3 重组病毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的构建 分别以pcDNA3.1-PRV-TK-CD2v 与pcDNA3.1-PRV-gI-p12为模板通过PCR分别克隆出包含同源臂的EGFP-CD2v与mCherry-P12的基因片段；将纯化后的片段与敲除载体共转染至HEK293T细胞并接种PRV，待细胞病变至80%时，收获细胞与上清，放置4℃待用。在Vero细胞中通过噬斑筛选获得F0代重组病毒，经过4轮噬斑筛选，最终在Vero细胞中扩增并纯化出阳性率为100% 的PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）重组病毒株。图1为重组病毒PRVΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）构建示意图。

Fig.1 重组毒株PRV-△gI-（p12）-△TK-（CD2v）构建示意图Fig.1 Schematic diagram of constructing recombinant strain（PRV-△ gI-（p12）-△ TK-（CD2v））

1.2.3 重 组 毒 株 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v） 的Western blot和荧光鉴定

1.2.3.1 重 组 毒 株 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的Western blot分析鉴定 在1×106个Vero细胞中接种1×103TCID50重组病毒，共培养36 h后提取总蛋白，用1 mL磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）清洗残余的培养基，加入80 μL蛋白质裂解液，用无菌细胞刮刀将细胞从培养皿中刮下，转移至1.5 mL离心管，冰浴15 min，14 000 r/min离心10 min，吸取上清，取1 μL上清用于蛋白质浓度测定，剩余上清与5×SDS Loading Buffer混合，98℃变性5 min；进行SDS-PAGE电泳，转膜，5%BSA室温封闭2 h，TBST清洗3次后与鼠源His单克隆抗体和鼠源flag单克隆抗体分别4℃孵育8 h，TBST清洗3次后孵育二抗，TBST清洗3次后扫膜鉴定。

1.2.3.2 重 组 病 毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的荧光鉴定 共聚焦皿中加入2×105个Vero细胞，并接种1×103TCID50的重组病毒；共培养36 h后在共聚焦显微镜下观察荧光。

1.2.4 重组病毒 PRV-ΔgI-（p12）- ΔTK-（CD2v）生物学特性分析

1.2.4.1 重组病毒 PRV-ΔgI-（p12）- ΔTK-（CD2v）的遗传稳定性测定 将重组病毒在Vero细胞上增殖30代，分别取10、20和30代细胞培养液上清，提取基因组，并用验证引物扩增，判断CD2v和P12能否在重组病毒中稳定存在。

1.2.4.2 重 组 病 毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）一步生长曲线测定 将重组病毒与野生型PRV病毒各取1×103TCID50分别接种至1×106个Vero细胞，分别在接种后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h收获培养上清及细胞并进行滴度测定。将收获的病毒液按10倍梯度稀释（10-1-10-7）并接种至1×106个Vero细胞中，共培养48 h后用4%的多聚甲醛固定细胞，用结晶紫染色统计噬斑并计算滴度绘制一步生长曲线。

1.2.5 重组毒株 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的安全性验证

1.2.5.1 重 组 毒 株 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的生存曲线测定 30只ICR小鼠分成3组，每组各10只。在适应性饲养7 d后，第1组在小鼠右后腿肌肉注射100 μL的生理盐水，第2组在小鼠右后腿肌肉注射100 μL滴度为1×105TCID50的重组病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v），第 3 组在小鼠右后腿肌肉注射100 μL滴度为1×105TCID50的野生型病毒PRV-Fa，连续观察15 d后绘制生存曲线。

1.2.5.2 苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining） 用4%多聚甲醛固定小鼠组织12 h，用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、95%乙醇和无水乙醇各处理30 min，后用乙醇和二甲苯1∶1混合透明处理，用二甲苯代替组织中的乙醇。组织用石蜡和二甲苯1∶1混合处理，然后植入石蜡中。将组织切成7 μm薄片，HE染色，后用显微镜进行形态学观察。

2 结果

2.1 重组质粒pcDNA3.1-PRV-TK-CD2V和pcDNA3.1-PRV-gI-P12的PCR鉴定及EGFPCD2V与mCherry-P12基因片段的纯化

以重组质粒为模板，使用表2中的引物3.1-P12与3.1-CD2V进行PCR扩增并纯化得到片段，其结果与目的基因大小相符，如图2-A所示。

2.2 重组病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的PCR鉴定

分别以野生型病毒PRV-Fa和重组病毒PRVΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的基因组为模板，用表2中的引物PRV-TK和PRV-gI进行PCR扩增，结果与片段大小相符，如图2-B所示；针对重组病毒的左右同源臂设计引物，分别以野生型病毒PRV-Fa和重组病毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的基因组为模板用表2中的引物进行PCR扩增并测序，判断插入位点，如图2-C-D所示。结果表明，CD2v与p12的片段均已插入到PRV的基因组中。

图2 同源重组片段制备及重组位点验证Fig.2 Preparation of homologous recombinant fragment and verification of recombination sites

表2 PCR扩增引物与验证引物Table 2 PCR primers for amplification and verfication

2.3 重组病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）遗传稳定性测定

将重组病毒 PRV-ΔTK-（CD2v）-ΔgI-（p12）接种在Vero细胞中传30代，取第10、20、30代细胞培养上清，富集病毒并提取基因组。用验证引物扩增CD2v与p12，结果显示均能扩增出目的基因，表明p12与CD2v基因能够稳定存在于重组毒株基因组中（图3-A）。

2.4 重组病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）western blot鉴定

在感染了重组毒株PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的Vero细胞中CD2v与P12均有表达，而感染PRVFa的Vero细胞中未检测到CD2v与P12条带。并且我们发现感染 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）中CD2v有3条带，分别为26 kD C端截短形式；45 kD非糖基化全长形式；89 kD 糖基化全长形式存在，如图3-B。这些结果说明CD2v与P12稳定表达的同时，ASFV的入侵对于CD2v的糖基化是非必须的。

2.5 重组病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的荧光鉴定

将野生型病毒PRV-Fa与重组病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）分别接种到Vero细胞中，培养24 h，通过荧光共聚焦显微镜检测，研究发现接种野生型PRV-FA的Vero细胞无任何荧光，而接种重 组 病 毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v） 的 Vero细胞中有绿色和红色荧光如图3-C。

图3 遗传稳定性鉴定Fig.3 Identification of genetic stability

2.6 重组毒株PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）一步生长曲线测定

用 Vero细胞测试了 PRV-Fa 与 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）一次性增殖曲线，如图4-E所示，重组 病 毒 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v） 在 Vero 细胞中增殖能力明显弱于强毒株PRV-Fa。

2.7 重组病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的安全性评估

为了评估重组病毒PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的生物安全性，我们用PRV-Fa与PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）两株病毒对小鼠进行接种，如图4-F所示，接种 PRV-Fa 组小鼠在接种第4天全部死亡，而接种 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）组小鼠观察至15 d未见死亡。此外，我们还观察到接种PRVFa组小鼠第3天开始出现严重的瘙痒，而在小鼠右后腿肌肉注射接种接种PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）组小鼠未见瘙痒症状，表明重组毒株安全性良好，对小鼠不具致死能力。

图4 重组病毒一步生长曲线与小鼠生存曲线Fig.4 One-step growth curve of recombinant viruses and mice’s survival curve

2.8 小鼠病理学评估

将接种PRV-Fa与PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）两株病毒的小鼠与空白小鼠器官进行HE染色，HE染色显示小鼠的心脏、肝脏和肾脏无明显变化，如图5-A、B和5-E所示。感染PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）小鼠脾脏组织淋巴细胞增殖明显，而PRVFa组与空白组无明显差异，如图5-C。PRV-Fa可导致肺部肿大与诱导脑内炎性细胞浸润，而对其他两组感染组则无明显影响，如图5-D和5-F。以上结果表明，PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）的毒力与PRV-Fa相比毒力减弱，同时也可以能激活免疫应答，引起免疫细胞增殖。

图5 小鼠组织病理学切片Fig.5 Histopathological sections of mice tissues

3 讨论

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒感染引起的一种急性、出血性、烈性传染病。该病是我国重点防范的一类动物疫病［1］。2018年8月，辽宁省沈阳市出现首例国内非洲猪瘟病例，至今疫情已扩散至全国［3］。我国为猪养殖与消费大国，猪出栏量、存栏量以及猪肉的消费量均位于全球首位，每年种猪及猪肉制品进口总量巨大，与多个国家贸易频繁，ASF带来的直接以及间接损失不可估量。

目前，针对非洲猪瘟疫苗制备已进行了多方面的尝试，如构建了灭活苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、病毒活载体疫苗与DNA疫苗等，但均未商业化［16］。其中利用天然分离或敲除毒力基因的ASFV弱毒和减毒活疫苗的免疫原性较好，研究进度较为乐观，但弱活疫苗安全性一直饱受诟病，需要综合评价毒株的不良反应与持续性感染等安全风险，并且需要大量的临床实验［17］。基因工程疫苗、ASFV亚单位疫苗、核酸疫苗，在安全性、鉴别诊断等方面优势明显，但由于ASFV基因组庞大和免疫逃逸机制复杂，需要在充分解析ASFV主要蛋白结构与功能、感染与免疫机制上进行更全面的研究［18-19］。

CD2v与P12为非洲猪瘟病毒囊膜蛋白，其中CD2v参与非洲猪瘟病毒的免疫逃逸，是晚期表达蛋白。CD2v蛋白与T细胞表面黏附因子CD2具有相似性，且CD2v与C型凝集素蛋白为ASFV重要保护性抗原［20］。P12参与病毒的附着过程，纯化的P12蛋白会与宿主细胞结合可阻止病毒与细胞的结合。因此，若能阻断CD2v及P12的功能则可提高宿主抗病毒能力及削弱病毒侵染能力［8］。CD2v与P12免疫源性强，其作为亚单位疫苗、DNA疫苗与病毒载体疫苗免疫后可诱导体液免疫应答及细胞免疫应答。而利用杆状病毒作为载体，表达CD2v的重组疫苗免疫猪后产生了抗体，并且攻毒后全部存活［21］。

PRV已被广泛应用于病毒载体疫苗的研发，其主要蛋白的功能已有较为全面的了解，并同时可诱导机体产生免疫应答。TK基因为PRV主要毒力基因，TK基因的缺失可显著降低PRV对神经细胞的侵袭性和猪的致病性，但免疫原性不受影响［22］。gI为PRV增殖过程中的非必须基因，通常在构建PRV弱毒活疫苗的过程中将其删除，gI的删除可降低病毒侵染能力使弱毒活疫苗更加安全［15，23］。目前，以PRV作为载体所研发的活病毒载体疫苗主要有猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒-猪伪狂犬病病毒重组疫苗［24］、猪圆环病毒 II 型-猪伪狂犬病病毒重组疫苗与猪瘟病毒-猪伪狂犬病病毒重组疫苗等［25］。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，利用PRV作为载体分别将ASFV CD2v与p12分别插入至PRV TK与gI中构建了重组表达ASFV CD2v及P12蛋白的重组毒株 PRV-ΔgI-（p12）-ΔTK-（CD2v）。CD2v与P12为非洲猪瘟病毒囊膜蛋白，这两种蛋白作为ASFV的重要抗原已被人证实安全有效。在用作亚单位疫苗与DNA疫苗时均能产生特异性抗体。本研究通过PRV活载体在vero细胞中成功表达出CD2v与P12，并且CD2v中还存在几种CD2v糖基化亚型。因此，CD2v的糖基化可能不依赖于ASFV的感染。而缺失的TK与gI基因则使得PRV的毒力降低，大大提高了安全性。通过小鼠器官HE染色发现与野生型毒株相比缺失TK与gI的毒株不引起小鼠脑部炎症与肺部肿大，但会引起小鼠脾脏的淋巴细胞增殖。这表明该重组病毒成功激活了小鼠的免疫系统。

本研究首次通过PRV为载体构建了表达非洲猪瘟病毒CD2v与P12蛋白的重组伪狂犬病毒，该重组毒株遗传性状稳定CD2v及P12可稳定表达、体外增殖能力良好、毒力弱、具有较好的安全性，其将为ASF及PR多价疫苗研发做铺垫。但还需要更多实验来验证该毒株是否可作为候选疫苗株，如验证该毒株在猪体内的有效性及可能存在的副作用。

4 结论

成功构建了表达非洲猪瘟病毒CD2v与P12蛋白的重组伪狂犬重组毒株，该重组毒株毒力弱安全性良好，该研究将为ASF疫苗研发提供新的借鉴。