细胞穿膜肽M918偶联抗体的表达纯化及其内吞效率研究

李雪 李俊敏 张雷 李杉

（华南理工大学生物科学与工程学院，广州 510006）

细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，CPPs）是一类由5-30个氨基酸组成可以穿透生物膜的短肽。CPPs可携带各种外源物质将其递送到细胞内［1-2］，与其他递送方式相比，这种有效的转运系统不受细胞类型的影响，能够与生物活性蛋白融合表达，具有较低的细胞毒性且在完成外源物质的递送后可降解［3］，近年来，在药物递送系统中得到广泛的应用［4］。穿膜肽M918衍生自抑癌蛋白p14ARF，由22个氨基 酸（MVTVLFRRLRLRIRRACGPPRVRV） 组 成，其中含有7个带正电荷的氨基酸，属于阳离子CPP。M918在高浓度条件下仍不具有细胞毒性，并且可以有效的将大分子外源物质（蛋白质和肽核酸）以共价结合物或非共价复合物的形式递送到动植物细胞中［5］。与大多数CPP相似，M918的穿膜机制主要为能量依赖的内吞机制，尤其是巨胞饮作用，不同的是M918的内吞不依赖于细胞表面的糖胺聚糖［6］。

近年来，靶向治疗受到越来越多的关注。单链抗体（single chain antibody，scFv）分子量低（约28 kD），结构简单，易于合成，免疫原性低，广泛的应用于靶向递送载体［7］。然而，由于大多数抗癌抗体及其衍生物在肿瘤组织中的渗透性较差，其递送效率受到严重的限制［8］，因此需要寻找一种新的靶向递送至肿瘤组织的方法。

在本研究中，将穿膜肽M918与靶向人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）的scFv偶联，经过纯化得到重组蛋白M918-scFv，通过微量热泳动（microscale thermophoresis，MST）技术和流式细胞仪检测M918-scFv与HER2抗原的亲和能力及内吞效率。旨在探索一种靶向递送的新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 PET-28b质粒由本实验室保存，PET-28b-scFv-EGFP质粒由本实验室构建、保存。穿膜肽M918基因序列由广州天一辉远基因科技有限公司合成。分子克隆所用的菌株为大肠杆菌DH5α感受态（TreliefTM5α Chemically Competent Cell，擎科生物科技有限公司，中国），表达重组蛋白所用的菌株为大肠杆菌BL21（DE3）感受态（BL21（DE3）Chemically Competent Cell，天根生化科技有限公司，中国）。HER2阳性乳腺癌细胞SK-BR-3，BT474及HER2阴性乳腺癌细胞MCF-7购于中科院上海细胞库。

1.1.2 主要仪器 Fusion Solo S化学发光成像系统（Vilber，法国）；BioLogic LP低压层析仪（BIO-RAD，美 国 ）；T100TMThermal Cycler PCR仪（BIO-RAD，美国）；SK-ⅡD超声波细胞破碎仪（宁波欧蓝，中国）；Accuri C6 plus 分析型流式细胞仪（BD，美国）；MO NT.115相互作用分析仪（Nano Temper，德国）；激光共聚焦显微镜（ZEISS，美国）。

1.2 方法

1.2.1 重组PET-28b-M918-scFv-EGFP质粒的构建 根据M918和scFv-EGFP的基因序列，用Premier 5软件设计基因扩增所需的引物（表1），由广州天一辉远基因科技有限公司合成。利用overlap PCR技术将基因片段M918与scFv-EGFP连接，以获得M918-scFv-EGFP基因片段。PCR产物回收后，用限制性核酸内切酶Nde Ⅰ和Hind Ⅲ分别双酶切PET-28b质粒和纯化回收后的M918-scFv-EGFP基因，酶切产物回收后用T4连接酶进行连接，并将连接产物用化学转化法转化到大肠杆菌DH5α感受态中，在卡那霉素抗性（终浓度为50 μg/mL）的LB固体培养基上培养过夜。挑选阳性转化子用通用引物进行菌落PCR鉴定并送天一辉远基因公司测序进行更进一步的验证，保存测序结果与目的基因比对正确的质粒并命名为PET-28b-M918-scFv-EGFP。

表1 扩增M918-scFv基因片段所需引物Table 1 Primers used to amplify M918-scFv

1.2.2 重组蛋白M918-scFv的表达、纯化 将上一步中测序结果正确的PET-28b-M918-scFv-EGFP质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，并接种于卡那抗性的LB液体培养基中，37℃ 220 r/min培养过夜作为种子液。按1∶100的比例转接种子液并培养至OD600≈1.5，向各组培养液中分别加入终浓度为300、500、800、1 000 μmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG）诱导蛋白表达，16℃ 130 r/min诱导过夜。比较在IPTG浓度不同时，重组蛋白M918-scFv-EGFP的表达情况，筛选出诱导M918-scFv-EGFP表达的最适IPTG浓度。用筛选出的最适IPTG浓度诱导重组蛋白大量表达，诱导结束后4℃ 6 700 r/min离心20 min 收集菌体，菌体沉淀可于-20℃保存。

用镍亲和层析纯化重组蛋白M918-scFv-EGFP。向收集到的菌体中加入适量的裂解缓冲液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L磷酸钠，20 mmol/L咪唑和2%（V/V）Tween-20，pH 6.8）充分重悬菌体，冰上超声破碎菌体（变幅杆Φ6、功率50%，超声1 s开、1 s关，40 min）。超声破碎结束后，4℃ 6 700 r/min离心30 min收集上清。将上清加载到预先用结合缓冲液（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L磷酸钠，20 mmol/L咪唑，pH 6.8）平衡好的Ni-NTA（Cytiva）上，缓慢梯度洗脱（20 mmol/L磷酸钠，0.5-1 mol/L NaCl，20-500 mmol/L咪唑，pH 6.8）目的蛋白。用SDS-PAGE检测纯化后的蛋白。纯化得到的蛋白经1×PBS透析和PEG-20000浓缩后，用BSA试剂盒测定蛋白浓度，Western Blot对获得的蛋白进行进一步的鉴定。

1.2.3 细胞培养 SK-BR-3和MCF-7细胞均置于含1%青链霉素混合液和10%胎牛血清的DEME高糖培养基中，BT474细胞置于含1%青链霉素混合液和10%胎牛血清的1640培养基中，在5% CO2，37℃的细胞培养箱中培养。待细胞增殖到适宜密度后进行扩大培养并进行试验。

1.2.4 HER2抗原结合实验 用Monolith NT.115仪通过MST技术评估纯化得到的scFv和M918-scFv与HER2抗原的结合能力。因为重组蛋白本身带有绿色荧光蛋白，因此仪器可根据GFP的荧光信号，检测抗原与重组蛋白scFv、M918-scFv结合后热泳信号的变化。用MST缓冲液（20 mmol/L 磷酸钠，50%（m/V）BSA，0.05%（V/V）Tween-20，pH 7.4） 配置100 nmol/L的scFv和M918-scFv溶液。将HER2抗原从400 nmol/L开始进行半倍稀释成16个梯度，与等体积的重组蛋白混合均匀并转移至毛细管中。将毛细管置于仪器中，在蓝光激发，LED power 20%的条件下进行测试。

1.2.5 内吞效率检测 用流式细胞仪检测细胞表面平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）。将处于对数生长期的细胞，以5×105个/mL的密度接种于6孔板中，各接种两板。37℃ 5% CO2培养24 h。分别向每孔中加入60 μg重组蛋白scFv和M918-scFv，并设置未加蛋白的孔做空白对照，4℃培养1 h。培养结束后，用提前预冷的1×PBS清洗。清洗结束后，各取一板细胞用流式细胞仪检测其细胞表明MFI，另一组细胞37℃继续培养2 h。培养结束后，用流式细胞仪检测其表面MFI，即可根据公式计算出重组蛋白的内吞效率［9］。

内吞（%）=（4℃表面总 MFI-37℃表面总MFI）/（4℃表面总 MFI）×100 %

用激光共聚焦显微镜观察M918-scFv的内吞。将3种细胞按5×103个/mL的密度接种在激光共聚焦皿中 37℃培养 24 h。加入 500 μL 5 μg/mL 的Hoechst 33342室温孵育30 min，孵育结束后用提前预热的培养基洗3次。再用过量的scFv和M918-scFv处理细胞，4、37℃孵育结束后，用激光共聚焦观察细胞。

1.2.6 数据分析 所有数据均进行3次独立重复实验，结果以平均值和标准偏差表示。用软件GraphPad Prism 7.0分析数据，使用软件中单边t检验，检验实验不同组之间的显著性差异，其中P＜0.05认为差异有统计学意义，P＜0.01认为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 PET-28b-M918-scFv-EGFP表达载体的构建

通过overlap PCR将穿膜肽M918基因片段与scFv基因片段连接，琼脂糖凝胶电泳结果如图1-A所示，目的片段在1 500 bp处，与M918-scFv分子量（约1.58 kb）大小相符，说明目的基因M918-scFv扩增成功。经双酶切、连接、转化后挑选适量个数的阳性转化子做菌落PCR，以验证载体构建结果。如图1-B所示，菌落PCR片段与预期值相符，测序结果与目的基因序列一致，说明PET-28b-M918-scFv-EGFP表达载体构建成功。

图1 重组质粒PET-28b-M918-scFv-EGFP的构建Fig.1 Construction of recombinant plasmid PET-28b-M918-scFv-EGFP

2.2 M918-scFv蛋白的纯化

用Western Blot检测（anti-His tag 抗体）优化诱导剂浓度结果如图2-A 所示，重组蛋白M918-scFv在上清和沉淀中均有表达，随着IPTG浓度的增加，目的蛋白的总表达量也会相应的提高，但上清中目的蛋白的含量呈先升高后降低的趋势，当IPTG浓度为800 μmol/L时，目的蛋白在上清中的表达量最高。

用筛选出的最适IPTG浓度诱导重组蛋白大量表达，并通过Ni-NTA进行纯化。在梯度洗脱过程中，在20% Buffer B洗脱时有目的蛋白（分子量约为57 kD）被洗脱下来，40% Buffer B洗脱时目的蛋白被大量洗脱，但此时杂蛋白较多。随着洗脱的继续进行，杂蛋白含量逐渐减少，此时目的蛋白纯度较高（图2-B）。

图2 重组蛋白M918-scFv-EGFP的纯化Fig.2 Purification of recombinant protein M918-scFv

将收集的60% Buffer B至100% Buffer B洗脱的重组蛋白，在含20%（V/V）丙三醇的1×PBS中透析24 h，用PEG-20000和超滤管浓缩蛋白，结果如图3所示。用BCA试剂盒测定重组蛋白M918-scFv的浓度为537.6 μg/mL；用软件Image J进行灰度值分析，蛋白纯度为90.5%，符合后续生物学活性验证标准。

图3 Western Blot鉴定纯化后的重组蛋白M918-scFFig.3 Identification of the purified recombinant protein M918-scFv by Western Blot

2.3 scFv、M918-scFv与HER2抗原的相互作用

scFv和M918-scFv与HER2抗原的结合解离常数Kd拟合曲线如图所示4，HER2抗原与scFv、M918-scFv的 Kd值 分 别 为（8.26±2.51）×10-9mol/L和（8.41±1.58）×10-9mol/L，且信噪比均大于5。scFv和CPP-scFv的Kd值都在10-9这一数量级，说明M918-scFv偶联穿膜肽后并不会影响scFv与Her2抗原的结合，M918-scFv保留了scFv特异性靶向HER2的能力。

图4 scFv（A）和M918-scFv（B）与HER2抗原的结合曲线Fig 4 Binding curve of scFv（A）and M918-scFv（B）to HER2 antigen

2.4 scFv、M918-scFv的内吞效率

用流式细胞仪定量计算重组蛋白的内吞效率，在4℃条件下培养细胞，细胞处于禁止外源物质内化进入状态，重组蛋白附着在细胞表面，而当在37℃条件培养细胞时，细胞处于允许外源物质内化进入细胞状态，重组蛋白可通过抗原抗体相互作用和穿膜肽的穿膜特性进入细胞内。因此细胞表面结合重组蛋白的内吞效率可通过37℃样品相对于4℃对照样品的MFI降低水平得到［10］。实验结果如图5所示，HER2阳性细胞与重组蛋白scFv、M918-scFv经过4℃孵育，再转移至37℃培养后，细胞表面的MFI均有一定程度的降低（图5-A、B），其中M918-scFv的效果更显著，在SK-BR-3和BT474中其内吞效率分别是scFv的1.8倍和1.5倍（图5-D）。而在HER2阴性细胞MCF-7中，由于细胞表面缺少HER2抗原，因此重组蛋白scFv、M918-scFv处理后细胞表面的MFI没有明显的变化。说明scFv、M918-scFv都是通过HER2特异性结合来结合细胞的，且通过偶联穿膜肽可以提高scFv的内吞。

图5 流式细胞仪检测scFv、M918-scFv在不同细胞系中的内吞效率Fig.5 Uptake studies of scFv and M918-scFv into different cell lines detected by flow cytometry

激光共聚焦显微镜观察结果与流式细胞仪检测结果相同。如图6所示，在HER2阳性细胞SKBR-3和BT474中，4℃孵育后，重组蛋白在细胞周围有明显的聚集；37℃孵育后，观察到明显的内吞，重组蛋白均匀的分布在细胞质中。在MCF-7细胞中，则观察不到重组蛋白的聚集。

图6 激光共聚焦显微镜观察scFv、M918-scFv在SKBR-3（A）、BT474（B）、MCF-7（C）中的内吞Fig.6 Uptake studies of scFv，M918-scFv into SK-BR-3（A），BT474（B） and MCF-7（C）cells observed by confocal laser scanning microscopy

3 讨论

CPPs自发现以来，就在药物递送领域得到了广泛的关注和应用。然而CPPs不受细胞类型的影响，未经修饰的CPP作为药物递送载体存在靶向性差，靶细胞摄取率低等问题，单凭CPPs无法使药物定向蓄积，使作用于靶细胞或靶组织的药物浓度减少，对正常组织损伤较大，限制了其作为药物载体的应用［11-12］。抗体能特异性识别肿瘤细胞靶分子，可将一定量的抑癌药物富集到肿瘤组织中，具有特异性高、性质均一及针对特定靶点定向制备等优点。由于单克隆抗体本身存在着筛选周期长，筛选效率低等问题，使其成为治疗的瓶颈［13］。scFv和传统的抗体相比具有显著的优势，即保持了原抗体的结合位点，又降低了一般异源性抗体的免疫反应，易于进行分子改造等优点［14］。

为此本研究利用抗体的靶向性及CPP的穿膜性能，使用基因工程手段将穿膜肽M918与靶向HER2的scFv偶联，构建了原核表达质粒。scFv是由全抗的重链可变区和轻链可变区组成的，不含Fc段。在蛋白表达过程中很容易形成“包涵体”沉淀表达［15］。低温诱导可降低目的蛋白的合成速率，从而增加目的蛋白的可溶性。诱导剂IPTG的浓度也会影响目的蛋白的溶解性。因此通过实验优化了融合蛋白上清表达的最适IPTG浓度，使重组蛋白主要在上清中表达并纯化了重组蛋白M918-scFv，获得的蛋白浓度及纯度均符合生物学验证标准。

MST实验结果表明穿膜肽与scFv偶联，不会影响抗体与抗原的相互作用。流式细胞仪及激光共聚焦实验结果表明偶联M918后，重组蛋白仍通过HER2特异性结合来结合细胞使重组蛋白M918-scFv获得了scFv的靶向性，解决了穿膜肽靶向性差的问题。同时在穿膜肽M918的作用下，提高了scFv在HER2阳性细胞中的内吞效率，重组蛋白M918-scFv兼具了穿膜肽的穿膜效率。与许多传统的穿膜肽相比，M918含有7个带正电的氨基酸，同时具有很低的两亲性，内吞不依赖于细胞表面的糖胺聚糖，因此更容易内化到细胞内，并且M918在递送蛋白质等大分子物质时表现出最佳的传递特性［16］。因此融合蛋白M918-scFv表现出良好的内吞效率。

4 结论

本研究将穿膜肽M918与靶向HER2的scFv偶联，成功的表达并纯化出重组蛋白M918-scFv。与单独的scFv相比，重组蛋白M918-scFv不仅表现出M918肽的穿膜特性，内吞效率显著提高，同时还保留了scFv的靶向性，重组蛋白能够靶向递送至HER2阳性乳腺癌细胞中。