山奈素对小鼠乙醇型胃溃疡的影响及其机制

吕帅宜，林开文，邓雨婷，张婉君，张钰苹，林桃姑，屈慧娟，魏娜

(海南医学院药学院，海南 海口 571199)

胃溃疡是以长期反复发作的周期性、节律性的上腹疼痛为主要临床表现的消化系统疾病[1]，主要是由黏膜进攻性因素(胃酸、活性氧等)与黏膜防御性因素(胃黏液和碳酸氢盐分泌、前列腺素、NO等)不平衡引起[2-3]。乙醇是引发胃黏膜损伤的重要原因之一，乙醇刺激可直接损伤胃黏膜毛细血管内皮细胞，造成血浆渗出和出血，引起胃腔内出血，加重组织缺血程度，从而影响胃黏膜正常的代谢及功能，减弱其抗损伤与修复的能力[4]。研究表明，乙醇诱导的胃溃疡主要由炎症和氧化应激引起，表现为胃黏膜广泛糜烂和出血斑块，并伴随大量促炎细胞和氧自由基产生和释放，免疫细胞在溃疡区域聚集，诱导淋巴细胞分化；此外，炎症细胞的聚集和组织浸润参与溃疡炎症反应导致局部或多发出血性溃疡以及组织变性和坏死，从而加剧胃黏膜损伤程度[2,5-7]。治疗胃溃疡的传统药物主要包括组胺受体2型拮抗剂(雷尼替丁)、质子泵抑制剂(奥美拉唑)及服用抗生素抑制幽门螺杆菌[8]。然而，上述传统药物均具有无法避免的不良反应。近期研究发现，药用植物与奥美拉唑或西咪替丁等传统药物的疗效相当甚至优于传统药物，且具有较少的不良反应[9]。现代药理学研究表明，高良姜黄酮类化学成分具有抗溃疡、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤等多种活性[10]，山奈素作为药用植物高良姜根中黄酮类化合物之一，具有抗氧化、抗炎和免疫调节作用[11]，本课题组前期对高良姜总黄酮进行了抗胃溃疡研究发现，其对胃溃疡具有一定疗效[12]。为进一步明确山奈素是否为高良姜抗乙醇型胃溃疡的有效成分，本实验对山奈素进行了抗溃疡活性及其机制研究。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及主要仪器

SPF级昆明小鼠60只，18～22 g，雌性，购自长沙天勤生物技术有限公司，动物合格证许可证号： SCXK(湘)2014-0011。饲养条件为12 h光/暗周期，室温 (24±1) ℃，40%～60%湿度，自由饮食。所有动物实验均按照《使用和照料实验动物国际准则》进行。

IL-1β、IL-6、前列腺素E2(PGE2)、TNF-α、NO及环氧合酶-2(COX-2)试剂盒均购自南京卡尔文生物科技有限公司；山奈素(成都麦德生物科技有限公司)；盐酸雷尼替丁胶囊(上海现代哈森药业有限公司)；NF-κB p65、COX-2、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、β-肌动蛋白兔抗小鼠单克隆抗体及HRP标记二抗均购自英国Abcam公司；蛋白酶抑制剂、蛋白裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、超敏ECL化学发光剂均购自上海碧云天试剂公司；CX41倒置显微镜(日本Olympus公司)；Synergy HTX多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)；凝胶成像系统、电泳仪(美国Bio-Rad公司)；CS150GXL高速低温离心机(日本Hitachi公司)；超声匀浆机(美国BioSpec公司)。

1.2 动物分组与给药及急性胃溃疡模型的建立

将60只小鼠随机均分为6组，每组10只，分别为正常对照组，模型组，雷尼替丁组，山奈素低、中、高剂量组。正常对照组和模型组给予0.5% 羧甲基纤维素钠，其他4组分别给予雷尼替丁(100 mg/kg)、低剂量山奈素(31.7 mg/kg)、中剂量山奈素(63.4 mg/kg)、高剂量山奈素(126.8 mg/kg)；所有小鼠灌胃容积均为20 mL/kg，连续给药7 d。在第7天最后一次给药前24 h小鼠禁食不禁水，并在最后一次灌胃给药后1 h，正常对照组用10 mL/kg生理盐水灌胃，其余组用无水乙醇10 mL/kg灌胃建立急性胃溃疡模型[13]，模型建立成功的标准为肉眼可见的胃黏膜出血和线型血斑。

1.3 样本采集及指标检测

1.3.1 溃疡指数及溃疡抑制率 建立急性胃溃疡后1 h，采用异氟烷进行麻醉，眼眶取血并迅速取出胃，沿着胃大弯剪开，用预冷生理盐水冲洗，放置在白色蜡板上，用相机拍摄胃组织病变部分，根据出血黏膜病变面积评估溃疡损伤指数，计算溃疡抑制率。

溃疡指数(UI)=1A+2B+3C；其中，A为≤1 mm的小溃疡个数，B为>1 mm 且≤3 mm的溃疡个数，C为>3 mm的线形溃疡个数。

抑制率(%)=(UI1-UI2)/UI1×100%；其中，UI1为模型组溃疡指数，UI2为山奈素各组溃疡指数。

1.3.2 胃组织病理分析 取小鼠胃组织，用4%多聚甲醛溶液固定，通过不同梯度乙醇脱水，70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、95%乙醇各60 min，无水乙醇30 min；二甲苯透明20 min；石蜡包埋。切片厚3 μm；经苏木素染色5 min；水洗返蓝；伊红染色3 min；水洗、脱水透明，封片；倒置显微镜下观察胃组织病理变化并进行分析评价。

1.3.3 ELISA法检测血清中炎症相关因子含量 通过眼眶取血方式采集小鼠血液(未添加抗凝剂)，静置4 h，于室温3 000 r/min离心5 min，收集血清；根据ELISA试剂盒方法检测血清中炎症介质TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2及NO含量。所有步骤均按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.4 免疫印迹法检测组织NF-κB p65、COX-2和iNOS蛋白表达 用含蛋白抑制酶的蛋白裂解液(RIPA)裂解胃组织，4 ℃行12 000 r/min离心5 min；收集上清蛋白。用BCA蛋白试剂盒测定蛋白浓度。用8% SDS-PAGE分离等量的蛋白质样品，采用90 V恒压将样品蛋白分离；恒压将目的蛋白转至PVDF膜，90 V，70 min(NF-κB p65、COX-2)和100 V，80 min(iNOS)；5%牛血清白蛋白封闭PVDF膜1 h，加入1 ∶2 000稀释的一抗(iNOS、NF-κB p65、COX-2及β-肌动蛋白)，4 ℃孵育过夜；TBST清洗6次，每次5 min；加入二抗(1 ∶10 000稀释)，室温摇床孵育2 h；用凝胶成像系统使用ECL超敏发光液检测蛋白条带，结果以目的蛋白/β-肌动蛋白来表示。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 胃组织的大体评价

与模型组相比，山奈素低、中、高剂量组溃疡指数显著降低(P均<0.05)。山奈素组溃疡抑制率呈剂量依赖关系，抑制率区间为44%～57%，其中高剂量抑制效果与雷尼替丁组相近，见表1。

正常对照组胃组织黏膜平整光滑，未见出血；与正常组相比，模型组表现为胃黏膜急剧损伤，表面粗糙，浅粉红色凹凸不平且胃壁变薄，有大面积广泛的出血性坏死和溃疡性血斑形成，说明成功建立乙醇诱导急性胃溃疡模型；而与模型组比较，山奈素组和雷尼替丁组胃组织损伤有显著改善，偶见出血点且高剂量组的抑制作用与雷尼替丁组相当。见图1。

表1 各组小鼠胃溃疡指数及溃疡抑制率比较

图1 各组小鼠胃黏膜组织损伤情况(20×)

2.2 山奈素对胃溃疡小鼠胃黏膜形态的影响

正常对照组小鼠胃黏膜上皮细胞排列整齐，黏膜下层和固有层无血水肿及炎细胞浸润；模型组小鼠胃黏膜细胞排列紊乱，黏膜上皮细胞脱落、坏死，大量炎症细胞(红颗粒)浸润组织，细胞收缩，腺体间隙增大；与模型组相比，山奈素组和雷尼替丁组组织结构完整性有所改善，黏膜损伤轻微，炎症细胞积累和浸润较少，但仍有腺体排列紊乱。见图2。

图2 各组小鼠胃组织HE染色结果(400×)

2.3 山奈素对胃溃疡小鼠血清中相关炎症因子含量的影响

与正常组对照相比，模型组小鼠血清中COX-2、PGE2、TNF-α、IL-1β、IL-6、NO均显著升高(P均<0.05)。与模型组相比，山奈素各剂量组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2及NO水平显著降低(P<0.05或<0.01，表2)。由此表明，山奈素可以抑制炎症因子分泌，减少胃溃疡炎症反应的扩大化。

2.4 山奈素对胃溃疡小鼠胃组织iNOS、COX-2、NF-κB p65蛋白表达的影响

与正常对照组相比，模型组胃组织中iNOS、COX-2和NF-κB p65蛋白表达明显升高(P均<0.05)；与模型组相比，山奈素组与雷尼替丁组胃组织中iNOS、COX-2和NF-κB p65蛋白表达明显降低(P<0.05或<0.01)。由此表明，乙醇刺激激活NF-κB/COX-2通路，而山奈素和雷尼替丁的处理则抑制这些蛋白的激活，从而减轻胃溃疡引起的炎症损伤。见图3。

表2 各组小鼠血清中相关炎症因子含量的比较

①： 正常对照组；②： 雷尼替丁组；③： 山奈素低剂量组；④： 山奈素中剂量组；⑤： 山奈素高剂量组；⑥： 模型组；a： P<0.05，与正常组比较；b： P<0.05，c： P<0.01，与模型组比较

3 讨论

研究表明，乙醇对胃黏膜的刺激可促进促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β分泌，故炎症也是乙醇诱发胃损伤的机制之一[14-15]。TNF-α含量升高可以增强微血管壁通透性，导致细胞解体释放溶酶体、炎性递质、趋化中性粒细胞，增强炎症局部淋巴细胞浸润和增殖[16]；促炎因子的级联反应由TNF激活开始，其次是IL-1β激活以及IL-6释放[17]，TNF-α主要由T细胞、单核吞噬细胞分泌，IL-1β是另一种诱导中性粒细胞积聚的细胞因子，可最终导致炎症介质释放[18]。IL-6作为典型的炎性细胞因子，能够刺激炎症部位的中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞产生各种有害产物、活性氧自由基和溶酶体酶，在溃疡的发生过程中起重要作用[19]。同时炎症诱导的iNOS产生的NO具有细胞毒性作用，能产生非特异性免疫反应介导细胞损伤[20]。本实验证明模型组小鼠NF-κB/COX-2通路处于激活状态，促进下游炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著性升高，iNOS活性增加，NO表达上调。

NF-κB是急性期炎症中许多细胞的重要转录因子，NF-кBp65是其亚单位；在小鼠胃溃疡组织中NF-κB被活化，抑制NF-κB活化则有利于溃疡修复[13]。生理情况下胃黏膜分泌的COX-2较少，病理情况下则分泌增加；COX-2是PGE2合成酶，PGE2可以通过增加胃黏膜上皮碳酸氢盐和黏液分泌、降低胃黏膜对H+的渗透性及维持黏膜血流等发挥胃黏膜保护作用[21-22]。抑制NF-κB/COX-2通路，可下调COX-2表达，降低氧化应激水平，延缓炎症发生发展[8]。本实验结果表明，山奈素和雷尼替丁均可以抑制NF-κB/COX-2蛋白表达并降低iNOS活性进而减少NO产生，且高剂量在抑制效果方面优于阳性药雷尼替丁。

综上所述，山奈素可能通过抑制NF-κB/COX-2通路，下调下游炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量，降低iNOS活性，抑制NO产生；此外，山奈素可能是一种潜在有效的胃溃疡补充药物，且高剂量组在各个相关指标实验中均优于中、低剂量，可为山奈素抗胃溃疡实验提供一定的剂量参考。此外，NF-κB作为关键转录因子，可经多种上游信号靶点的信号转导导致自身活化，因此山奈素抗胃溃疡与NF-κB信号通路中关键靶点间的关联性还需进一步研究。