小鼠角质形成细胞培养研究进展

金铭，刘莉萍，李遇梅

(江苏大学附属医院皮肤科，江苏 镇江 212001)

角质形成细胞又称角蛋白形成细胞，来源于外胚层，是表皮的主要细胞类型，约占表皮的95%。根据角质形成细胞不同分化阶段的细胞特点，将表皮分为5层：基底层、棘层、颗粒层、透明层和角质层，其中基底层是未分化的细胞，具有分裂增殖能力[1]。角质细胞构成完整的皮肤屏障以抵御外界各种物理、化学物质和病原微生物的损伤，当这层屏障由于外伤、感染、免疫反应等原因功能受损时，将会导致一系列皮肤疾病的发生，比较典型的有银屑病、天疱疮、大疱性表皮松懈症。因此目前有很多与之相关的研究，例如上皮生物学、角质细胞分化以及角质细胞刺激先天免疫反应[2]等等。近年来，为了更好地修复皮肤慢性损伤、烧烫伤，人工皮肤的研究进行得如火如荼，而角质细胞在人工皮肤的构建方面是必不可少的[3-4]。

小鼠是当前用于研究人类疾病最重要的模式生物，通过基因编辑技术，小鼠角质细胞已被广泛用于研究表皮屏障、瘢痕形成、银屑病等生理病理机制以及关键分子的调控[5-8]。其中，角质形成细胞的维持培养为此类研究提供了不可或缺的体外模型。小鼠角质细胞的培养起始于20世纪70年代，半个世纪以来，培养技术和方式在不断改进和细化。然而，小鼠角质细胞在体外传代过程中很容易发生分化和衰老，而且存在贴壁困难、成纤维细胞污染等问题。本文回顾了近年来国内外有关小鼠角质细胞分离培养的文献，总结影响其体外增殖、分化的各个因素，以期建立更加优化的培养体系。

1 小鼠相关参数确定

1.1 品系的选择

多种品系的小鼠均可用于角质形成细胞的来源，但不同的小鼠品系之间，角质细胞的培养寿命和质量各不相同。与FVB/N、CD-1、C57BL/6或SENCAR品系的小鼠相比，BALB/c小鼠角质形成细胞的初始贴壁率最低，衰老倾向最高[9]。

1.2 小鼠年龄和取材部位的选择

不同鼠龄的小鼠取材部位不同，对于出生0～3 d的新生小鼠，最佳的取材部位是背部皮肤，因为此时是毛囊形成早期，毛囊数量很少[10]，对后续表真皮的分离影响较小。而对于成年小鼠，最佳的取材部位则是尾部而非背部，因为：① 成年小鼠的毛发周期处于休眠期(通常是出生后6～12周的背部皮肤)，此时的皮肤很薄，仅包含1～2层细胞，这将会导致角质细胞产量低下；② 成年小鼠背部皮肤的毛囊密度较高，这增加了表皮与真皮分离的困难程度；③ 尾部皮肤部位上皮细胞较厚，有3～5层角质细胞，并且还具有较低的毛囊密度，不干扰表真皮分离[2]。

2 消化酶的选择

小鼠角质细胞的原代培养方式有3种：组织块培养法、气-液交界面培养法和酶消化法。目前应用最广的是二步酶消化法[11-12]，即先使用表真皮分离酶分离表真皮，再对表皮进行消化得到角质细胞。此外，也有研究使用一步法，即在表真皮分离的同时对表皮进行消化。

2.1 表真皮消化酶

表皮和真皮通过半桥粒和基底膜带连接。基底膜带由包膜层、透明层、致密层和致密下层等4层结构组成，主要成分为板层素、Ⅳ型胶原等。目前有多种消化酶可用于表真皮分离，它们作用于不同的结构，产生的结果也不尽相同。

2.1.1中性蛋白酶 中性蛋白酶是目前应用最广的表真皮分离酶[2，13]。它是由枯草芽孢杆菌经发酵提取获得的，由于特异性作用于基底膜 Ⅳ型胶原和纤维黏连蛋白，因此只破坏半桥粒，而不破坏桥粒，不会影响表皮细胞之间的连接[14]。

2.1.2 胰蛋白酶 胰蛋白酶作用强度大，且操作最为简单方便，也常常用于分离表真皮[9，15]。它在破坏半桥粒的同时也破坏桥粒的连接作用，因此会作用于基底细胞和棘细胞，可实现一步法分离角质形成细胞。然而，此种方法易造成基底细胞丢失和成纤维细胞污染的问题[16]。

2.1.3 嗜热菌蛋白酶 嗜热菌蛋白酶是从嗜热微生物芽孢杆菌培养滤液中分离出的一种热稳定的胞外金属内肽酶[17]，它是特异性地作用于真皮-表皮交界处的一种特定蛋白，利用这种酶可以获得完整的表皮[18]。Rakhorst等[19]比较了中性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶对表真皮分离的作用，发现在中性蛋白酶的作用下，表真皮更易分离、角质细胞的产量更高。而且，由于嗜热菌蛋白酶价格较高，因此应用不多。

综上，考虑到酶的作用原理、效果以及产品价格等综合因素后，目前更推荐中性蛋白酶用于表真皮的消化分离。

2.2 表皮消化酶

角质形成细胞间主要通过桥粒连接，破坏此结构可使角质细胞之间相互分离，从而收集到角质细胞。

2.2.1 胰蛋白酶-EDTA 由于乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA)能够螯合Ca2+和Mg2+，从而破坏细胞连接促进细胞的解离，因此在胰蛋白酶中加入EDTA后，解离效果更加明显，不仅有利于表皮角质细胞的分离，也可减少胰蛋白酶对细胞的损伤。

2.2.2 TrypLE解离酶 TrypLE解离酶不含动物和人源性成分，且对细胞的作用十分温和。终止消化时，不需要使用胰蛋白酶抑制剂，因此可避免血清对角质形成细胞造成的负面影响。此外，TrypLE可在室温下保存，性状稳定。因此是替代胰蛋白酶的理想试剂。

目前的研究大多先使用中性蛋白酶分离表真皮，再通过胰蛋白酶-EDTA或者TrypLE解离酶消化表皮[20]进一步得到角质细胞。这种消化组合不仅可以在高效分离出角质细胞的同时避免成纤维细胞的污染，还能提高贴壁细胞的增殖率[12]。

3 培养基的选择

小鼠角质细胞的培养已有50年的历史，其培养基也在逐渐改良创新。目前，小鼠角质细胞的培养基大致可以分为含血清与不含血清两大类。

3.1 含血清培养基

这类培养基一般在EMEM/S-MEM基础培养基中加入胎牛血清、氯化钙、上皮生长因子、氢化可的松等成分。其中，胎牛血清虽然富含最全面的细胞培养所需的营养物质，例如白蛋白、胎球蛋白、Ig类抗体、胆固醇等，可以帮助细胞抵御外界的各种环境变化带来的冲击，但血清中的钙离子抑制角质形成细胞的生长并诱导角质形成细胞的终末分化。因此，需先用螯合树脂处理血清，以去除包括钙离子在内的二价和三价阳离子，才能显著降低对细胞生长的抑制作用[21]。

3.2 不含血清培养基

这类培养基通过加入一些成分明确的血清替代成分，例如牛血清白蛋白等，可避免血清给角质形成细胞带来的诸多不利因素。目前最常用的商业化无血清培养基有以下几种。

3.2.1 EpiLife无血清培养基 有研究表明，与添加了螯合处理血清的培养基相比， EpiLife培养基在促进成年小鼠角质细胞增殖、保持基底细胞形态方面表现更为优秀[2]。也有研究比较了几种不同的商业化无血清培养基，发现EpiLife在促进角质细胞增殖方面的作用较为突出[22]。

3.2.2 CnT(CELLnTEC)系列培养基 CnT系列培养基是CELLnTEC公司最新研发的针对角质细胞培养的一类培养基，根据作用原理和效果不同主要分为以下几类，① CnT-57：含有少量(6 μg/mL)的牛垂体提取物(bovine pituitary extract, BPE)，它对于体外维持祖细胞的未分化增殖状态具有重要作用，能提供最大的角质细胞分离效率，维持良好的原代细胞生长状态，但也能支持原代培养中黑素细胞或成纤维细胞的生长[23]。② CnT-07：也是促祖细胞增殖培养基。与CnT-57相比，分离角质细胞后的集落形成效率稍低，但不支持除角质细胞以外的其他细胞的生长[23]，是目前使用最多的促角质细胞生长的CnT培养基。③ CnT-PR：是一种成分明确、不含动物成分的培养基。它是CnT-07培养基的改进版本，优化了培养基的成分，添加了额外的微量元素、抗氧化剂和维生素，还补充了一系列的前体细胞靶向生长因子以及辅助因子，以延长祖细胞寿命、改善生长因子与膜结合受体的结合。④ CnT-02：用于角质形成细胞的分化培养。当细胞被诱导分化时，用以代替促进增殖的CnT-57或CnT-07培养基[23]。CnT-PR-D作为CnT-02分化培养基的改良版本，添加了额外的微量元素、抗氧化剂和维生素，使得对角质细胞的分化作用更为显著。

3.2.3 成分确定的角质形成细胞-无血清培养基(defined keratinocyte-SFM) 不添加BPE，取而代之的是生长促进剂，这些生长促进剂可维持细胞形态、生物标志物和生长特性，并可抑制成纤维细胞的增殖。此培养基钙浓度很低(<0.1 mmol/L)，因而可用于高密度未分化角质形成细胞的分离和培养。

3.2.4 KGM-Gold角质形成细胞生长培养基 旨在支持克隆生长和高密度角质细胞增殖。在此培养基培养条件下的角质细胞能通过严格的质量控制，确保过大的和空泡化的细胞数量最少。

4 影响角质细胞培养的重要因素

4.1 钙离子

钙浓度的变化会影响角质形成细胞的分化。在不同钙浓度培养条件下，细胞的增殖能力出现明显的差异。研究表明，低钙浓度下(<0.07 mmol/L)，角质形成细胞可良好增殖，但不能分化为层状细胞；当钙浓度超过0.1 mmol/L时，角质细胞的增殖受到抑制，而分化过程被启动[24]。因此，目前的体外培养体系中多采用低钙来延长原代角质形成细胞的寿命[25]，研究者也可根据实验需要调节培养基中的钙离子浓度。

4.2 生长因子

4.2.1 表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF) EGF是一种由53个氨基酸残基组成的耐热单链低分子多肽，参与上皮细胞成熟，它与EGF受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)结合，后者广泛分布于哺乳动物的上皮细胞膜上，平均每个正常上皮细胞约有(2～5)×104个EGFR分子[26]，EGF和EGFR的结合会影响角质细胞的增殖、分化和迁移[27-28]。

4.2.2 角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF) KGF是成纤维细胞生长因子家族的成员，由间质来源的细胞产生，并通过与位于上皮的KGF受体连接而具有旁分泌功能[29]。KGF通过上调与DNA合成相关的基因如c-myc、CHL-1等，促进细胞有丝分裂。研究表明，KGF促进角质细胞增殖的作用强度是EGF的2～10倍[30]。

4.3 镁离子

研究表明，培养基中添加高浓度镁离子(最适浓度5～6 mmol/L)可使新生鼠角质形成细胞DNA含量增加3～4倍。其他二价阳离子(锶、铜、锌、镍、铍和钡)在培养基中不能促进角质形成细胞的生长[31]。此外，镁离子可能通过与细胞表面的蛋白螯合，形成表面蛋白膜，从而促进角质细胞贴壁生长[32]。总之，镁离子可以促进角质细胞的增殖，提高贴壁率和细胞的生长速率。

4.4 1,25-二羟维生素D3

1,25-二羟维生素D3是胆固醇衍生物维生素D3的一种活性形式，对于骨代谢、钙代谢的调节，细胞生长分化，免疫系统功能和中枢神经系统功能都有重要调节作用[33-34]。研究表明，1,25-二羟维生素D3通过上调周期蛋白D1(CCND1)基因和其编码的cyclin D1蛋白表达刺激角质细胞的增殖[35]。

除了上述几种因素外，部分激素如氢化可的松、胰岛素以及霍乱毒素等都能显著促进角质形成细胞的增殖、生长。其中胰岛素通过促有丝分裂作用刺激角质形成细胞的增殖[36]；霍乱毒素作为一种环状单磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)的诱导剂，对于角质细胞的生长具有较强的促进作用[37]。

5 小鼠角质细胞的应用展望

经过半个世纪的研究和探索，小鼠角质细胞的培养尤其是原代培养取得了很大的进展，然而，如何维持其干性、促进增殖依然存在着较大困难和挑战。建立成熟完善的小鼠角质形成细胞的分离和培养体系，将有助于研究细胞间的相互作用，构建细胞分化模型以及三维皮肤替代物，进而服务于瘢痕形成、银屑病、皮肤肿瘤等病理过程的机制探索，并助力皮肤相关的再生研究。结合最新的细胞重编程技术，还能将其应用于各类体内外的转化研究，例如将角质细胞转化为干细胞、黑素细胞等，这将为细胞治疗和再生医学的研究和发展带来裨益。相信在不久的将来，一套成熟的小鼠角质细胞培养体系能够被建立起来。