雌激素联合机械张力调控人牙周膜成纤维细胞成骨分化及机制研究

赵 玺，李向宇，丁 锐，赵浩然，米丛波，吴晓琴

人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts，hPDLF)是一个异质性细胞群，参与牙周组织的改建和再生，hPDLF细胞在特定的刺激下，能够促进其向成骨细胞分化，参与组织的修复和牙槽骨的改建[1-4]。亦有研究表明[5]，雌激素与其受体结合后能够促进牙周膜成纤维细胞在骨重建过程中核因子κB受体活化子配体及骨保护素的表达，进而影响牙槽骨的重建。正畸治疗时机械力作用于牙齿通过牙周膜传递至牙槽骨，继而牙槽骨发生生物改建，包含了成骨细胞和破骨细胞的分化成熟[6-8]，所以，本文即探究联合使用雌激素和机械治疗能否影响hPDLF细胞的成骨分化及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

α-MEM培养基(美国Gibco公司)；17β-雌二醇(美国Sigma公司)；cDNA合成试剂盒、qPCR检测试剂盒(南京福麦斯生物技术有限公司)；酶标仪(美国BioTek公司)；实时定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；茜素红染色液(沈阳万类生物技术有限公司)；骨钙素(osteocalcin，OCN)、骨桥蛋白(osteopontin, OPN)、β雌激素受体(Estrogen Receptor-β, ER-β)、蛋白激酶B(protein kinases, Akt)、p-蛋白激酶B(p-protein kinases, p-Akt)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)一抗，山羊抗兔二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)，FX-5000T应力加载系统(购自美国 FlexCell公司)。

1.2 人牙周膜成纤维细胞的分离与鉴定

收集健康正畸患者的健康前磨牙6颗，患者年龄18～25岁，征得患者的知情同意。取得患者前磨牙样本后迅速转移至无菌的超净工作台中，用无菌的PBS溶液冲洗3次，然后用无菌手术刀片刮取根中1/3区域的牙周膜组织，将组织转移至α-MEM培养基中，使用无菌眼科剪将组织剪成1 mm3，研磨均匀，将牙周膜组织碎块均匀放置在6孔板中，加入含10%胎牛血清的α-MEM培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，隔天更换培养基，细胞生长至汇合率达80%时，使用0.25%的胰蛋白酶消化，传代。提取细胞蛋白，Western blot检测牙周膜成纤维细胞标志蛋白波形丝蛋白(Vimentin)和细胞角蛋白(CK)的表达。

1.3 细胞给药及细胞加力

将分离的hPDLFs接种于6孔板中，分别加入17β-雌二醇使其终浓度为0、1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L，共孵育24 h后，使用MTT法检测雌激素对牙周膜成纤维细胞增殖能力的影响，以确定最佳给药浓度，根据参考文献[7]，设置细胞加力条件为：将细胞消化后，以1×108个/L分别接种于加力用细胞培养板中1/3部分，每板接种1 mL细胞悬液(即1×105个/板)，置于37 ℃恒温孵箱中培养。使用 FX-5000T 应力加载系统分别刺激细胞12 h，振幅10%、频率 0.5 Hz，每个循环中松弛和拉伸时间各1 s，按照上述处理方式，设置细胞分组为对照组、17β-雌二醇组、机械张力组、17β-雌二醇组联合机械张力组。

1.4 MTT法检测细胞增殖

取处理后的hPDLF细胞以4×103个/孔接种于96孔板，每孔200 μL，每组5个复孔，培养24 h后每孔加 MTT溶液20 μL，继续培养 4 h，去除孔内的MTT溶液，每孔加DMSO 200 μL，酶标仪490 nm处测定各孔的光密度值(OD值)，OD值越大，细胞增殖能力越强。

1.5 茜素红染色检测hPDLF细胞成骨分化

配制成骨诱导液(10 mmol/L β-甘油磷酸钠，50 mg/L维生素C，10 nmol/L地塞米松，10%胎牛血清，α-MEM培养基)，分别设置为对照组(成骨诱导液)、诱导17β-雌二醇组(成骨诱导液，1×10-7mol/L 17β-雌二醇)、诱导机械张力组(成骨诱导液，机械张力)、诱导17β-雌二醇+机械张力组(成骨诱导液，1×10-7mol/L 17β-雌二醇、机械张力)，培养细胞21 d，去除培养基后使用4%多聚甲醛溶液固定20 min，加入茜素红染液，37 ℃孵育15 min，弃茜素红染液加入200 μL 10%氯化十六烷基吡啶溶解1 h，收集染色液，分光光度计590 nm处检测光密度值(OD)。

1.6 qRT-PCR检测成骨基因mRNA的表达

取各组处理后的hPDLF细胞，消化细胞至离心管中，加入Trizol裂解5 min，取上述细胞裂解液加入200 μL氯仿，静置5 min后，于12 000×g，4 ℃离心15 min，转移上层水相，加入500 μL异丙醇，12 000×g，4 ℃离心10 min，去上清，1 mL 75%乙醇清洗RNA沉淀后，20 μL RNA-free水重悬RNA沉淀，55 ℃水浴10 min，即为总RNA，使用核酸定量仪检测总RNA含量。根据cDNA Synthesis 试剂盒指示配置反应体系，将提取的hPDLF细胞RNA逆转为cDNA，然后利用核酸定量仪对cDNA进行定量。然后根据qPCR试剂盒指示配置反应体系，进行qPCR反应，采用GAPDH作为内参，反应后采用2-ΔΔCt法计算基因表达水平。引物序列见表1。

表1 RUNX2、OCN、OSX、OPN、GAPDH引物序列Tab.1 RUNX2, OCN, OSX, OPN, GAPDH primer sequences

1.7 Western blot

取各组hPDLF细胞1×106个于离心管中，每管中加入500 μL的RIPA蛋白裂解液和5 μL的苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)蛋白酶抑制剂，于冰上充分裂解30 min，裂解液12 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清，即为细胞总蛋白。BCA蛋白定量后，各组蛋白加入上样缓冲液后，沸水浴加热变性，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，用5%的脱脂牛奶对偏氟乙烯(polyvinglidene fluoride, PVDF)膜封闭2 h，然后以1∶1 000比例稀释后的成骨相关蛋白OCN、OPN一抗，ER-β、Akt、p-Akt、GAPDH一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后二抗室温孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL试剂盒说明书配置发光液，并将PVDF膜浸入发光液中反应半分钟，曝光并拍照，用Image J软件对曝光结果进行定量分析。

1.8 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，所有数据多组间差异进行单因素方差分析，行双侧检测，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 hPDLF细胞鉴定结果

为鉴定提取到的hPDLF细胞，首先在显微镜下拍照观察细胞形态，如图1A所示，所分离的hPDLF细胞形态呈长梭形，细胞核呈圆形状态，细胞长满瓶底后呈旋涡状，符合hPDLF细胞的形态特征；Western blot鉴定hPDLF细胞标志蛋白结果(图1B)显示，所分离的hPDLF细胞表达Vimentin和CK，证明本文从牙组织中提取到了hPDLF细胞，可用于后续研究。

A：hPDLF细胞形态结构；B：Western blot检测Vimentin和CK表达图1 hPDLF细胞鉴定结果Fig.1 Results of hPDLF cell identification

2.2 17β-雌二醇对hPDLF细胞增殖能力的影响

为了验证17β-雌二醇对hPDLF细胞增殖能力的影响，分别用1×10-9、1×10-8、1×10-7mol/L 17β-雌二醇处理hPDLF细胞，并设置0 mol/L组作为空白对照，MTT检测结果(图2)显示，1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L 17β-雌二醇处理hPDLF细胞后，各组hPDLF细胞的OD值均显著高于对照组，1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L 17β-雌二醇组细胞OD值最大，细胞增殖能力最强，且给药浓度超过1×10-7mol/L时，OD值无显著增加，所以选择1×10-7mol/L作为给药浓度，进行后续实验。

2.3 雌激素联合机械张力促进hPDLF细胞的增殖能力

为了探究雌激素联合机械张力对hPDLF细胞增殖能力的影响，将hPDLF细胞分别经过1×10-7mol/L 的17β-雌二醇、机械张力以及二者联合处理后，MTT检测增殖能力结果(图3)显示，17β-雌二醇、机械张力处理hPDLF细胞后，细胞的增殖能力均显著高于空白对照组(P<0.05)，而雌激素联合机械张力组细胞增殖能力高于17β-雌二醇和机械张力单独诱导组(P<0.001)，说明雌激素联合机械张力能够显著促进hPDLF细胞的增殖能力。

与0 mol/L 17β-雌二醇组相比，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001图2 MTT法检测17β-雌二醇对hPDLF细胞增殖能力的影响Fig.2 MTT method was used to detect the effect of 17β-estradiol on the proliferation of hPDLF cells

2.4 雌激素联合机械张力促进hPDLF细胞成骨基因的表达

为了探究雌激素联合机械张力对hPDLF细胞成骨分化的影响，本文将hPDLF细胞经过雌激素和机械张力的刺激后，检测成骨相关基因的表达，qPCR结果(图4)显示，17β-雌二醇和机械张力单独作用组hPDLF细胞成骨相关基因RUNX2、OCN、OSX、OPN表达显著高于对照组(P<0.05)，而17β-雌二醇联合机械张力组细胞中RUNX2、OCN、OSX、OPN表达显著高于17β-雌二醇和机械张力单独作用(P<0.01)，说明雌激素联合机械张力促进hPDLF细胞的成骨分化。

与对照组相比，*：P<0.05，***：P<0.001；与17β-雌二醇组相比，###：P<0.001；与机械张力组相比，aaa：P<0.001图3 MTT法检测雌激素联合机械张力对hPDLF细胞增殖能力的影响Fig.3 MTT method was used to detect the effect of estrogen combined with mechanical tension on the proliferation ability of hPDLF cells

与对照组相比，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001；与17β-雌二醇组相比，##：P<0.01，###：P<0.001；与机械张力组相比，aa：P<0.01，aaa：P<0.001图4 qPCR检测雌激素联合机械张力促进hPDLF细胞对成骨基因的表达的影响Fig.4 qPCR detection of the effect of estrogen combined with mechanical tension to promote hPDLF cells on the expression of osteogenic genes

2.5 雌激素联合机械张力促进hPDLF细胞成骨分化

茜素红染色检测雌激素和机械张力对hPDLF细胞成骨分化的影响，结果(图5)显示，17β-雌二醇和机械张力单独作用组hPDLF细胞茜素红OD值显著高于对照组(P<0.01)；17β-雌二醇联合机械张力组茜素红OD值显著高于17β-雌二醇和械张力单独作用组(P<0.001)；说明雌激素联合机械张力可显著促进hPDLF细胞的成骨分化。

与对照组相比， **：P<0.01，***：P<0.001；与17β-雌二醇组相比，###：P<0.001；与机械张力组相比，aaa：P<0.001图5 茜素红染色检测雌激素和机械张力对hPDLF细胞成骨分化的影响Fig.5 Alizarin red staining was used to detect the effect of estrogen and mechanical tension on osteogenic differentiation of hPDLF cells

2.6 雌激素联合机械张力促进成骨相关蛋白OCN、OPN表达及ER-β表达

Western blot检测结果(图6)显示，经过17β-雌二醇和机械张力作用后，成骨相关蛋白OCN、OPN表达显著增加(P<0.01)，雌激素受体ER-β表达显著增加(P<0.05)，17β-雌二醇和机械张力联合作用后，hPDLF细胞中OCN、OPN表达显著增加(P<0.001)，ER-β表达亦显著增加(P<0.001)，说明雌激素联合机械张力能够促进hPDLF细胞成骨分化，及上调雌激素受体ER-β的表达。

2.7 雌激素联合机械张力促进Akt信号通路的激活

Western blot检测结果(图7)显示，相比于对照组，17β-雌二醇组、机械张力组hPDLF细胞p-Akt磷酸化水平显著增加(P<0.01)；而17β-雌二醇组+机械张力组hPDLF细胞p-Akt磷酸化水平均显著高于17β-雌二醇组和机械张力组(P<0.001)，说明雌激素联合机械张力能够显著促进Akt信号通路的激活。

3 讨 论

hPDLF细胞是牙周膜中的主要细胞，在牙周疾病、正畸等治疗中，hPDLF的成骨分化功能发挥关键作用[9]。已有研究表明，雌激素可影响hPDLF细胞的增殖活性，促进其成骨分化以及骨重建[10]。同时，hPDLF细胞是一种对应力敏感的细胞，受到机械应力后，将力学信号转变为生化或生理信号，细胞骨架蛋白是最直接的外力感受器，调节受体的信号转导[10-14]。在正畸治疗中，机械张力发挥主要的治疗作用，研究表明，在机械张力作用下， hPDLF细胞具有最佳的增长活力[15]。本研究就主要探究了在雌激素和机械张力的联合作用下，hPDLF成骨分化的变化及机制。

与对照组相比，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001；与17β-雌二醇组相比，###：P<0.001；与机械张力组相比，aaa：P<0.001)图6 Western blot检测雌激素联合机械张力对OCN、OPN、ER-β表达的影响Fig.6 Western blot was used to detect the effect of estrogen combined with mechanical tension on the expression of OCN, OPN, ER-β

与对照组相比，**：P<0.01，***：P<0.001；与17β-雌二醇组相比，###：P<0.001；与机械张力组相比，aaa：P<0.001)图7 Western blot检测雌激素联合机械张力对Akt信号通路的影响Fig.7 Western blot was used to detect the effect of estrogen combined with mechanical tension on the Akt signaling pathway

本研究发现，雌激素联合机械张力诱导后，hPDLF细胞的增殖能力显著高于雌激素单独作用和机械张力单独作用组细胞的增殖能力，并且茜素红染色结果显示，雌激素联合机械张力诱导后hPDLF细胞的成骨分化水平亦显著增加，说明雌激素联合机械张力能够促进hPDLF细胞的成骨分化，提示雌激素联合机械张力或许可以用于口腔疾病的治疗，以提高治疗效果。

接下来，本文即探究了其发挥促成骨分化的作用的机制，RUNX2、OCN、OPN、OSX是hPDLF细胞成骨分化的标志蛋白，可作为评价hPDLF细胞成骨分化的标志物，本研究发现，雌激素联合机械张力诱导hPDLF细胞后RUNX2、OCN、OPN、OSX表达显著增加，说明雌激素联合机械张力可促进成骨分化相关基因的表达而发挥促分化的作用，并且雌激素联合机械张力诱导后雌激素受体ER-β表达亦增加，说明二者联合使用可通过上调ER-β表达而促进雌激素发挥功能。

PI3K/Akt信号通路的激活是通过Akt的磷酸化实现，活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游一系列底物，从而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等[16-18]。并且已经有研究表明，rhBMP9 作用于 hPDLF后可通影响PI3K/AKT 信号通路而调控成骨分化[19-20]，所以本文亦研究了雌激素联合机械张力对hPDLF细胞PI3K/Akt信号通路的影响，结果显示，激素联合机械张力能够显著激活PI3K/Akt信号通路。

综上所述，雌激素联合机械张力能够促进hPDLF细胞的成骨分化，上调成骨相关基因的表达，上调雌激素受体ER-β表达，以及激活PI3K/Akt信号通路，但其精细机制及临床应用还需进一步验证。