水热预处理竹材制备低聚木糖和单糖的研究

詹云妮，黄 晨,，郝 昕，王梓萌，邓拥军,，房桂干,*

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室；国家林业和草原局林产化学工程重点实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏 南京 210042；2.南京林业大学 江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210037)

随着世界经济的迅速发展，人们对资源的消耗和需求量不断提高，由此引发的能源危机、资源短缺和环境问题受到越来越多的关注。因此，开发利用可再生能源逐渐成为研究的热点[1-2]，而木质纤维素制备燃料乙醇则是可再生能源研究的重要方向之一[3]。酶解木质纤维制备燃料乙醇是较为常用的一种方法，原料中的木质素和半纤维素的存在阻碍了纤维素酶与纤维素的接触。因此，为获得较高的酶解效率，首先需要对木质纤维原料进行预处理[4-5]。在众多的预处理方法中，水热预处理由于清洁、高效及低成本等特点而受到学者们的青睐[6]。水热预处理不需要额外添加任何化学试剂，环境负荷小，具有良好的发展前景[7-8]。同时，水热预处理过程中木聚糖大量降解，且主要以低聚木糖(XOS)的形式存在于水解液中，因而也被广泛应用于XOS的制备。大量研究已证实XOS是一类益生元，能够有效增殖动物肠道内的有益菌群，促进动物健康[9]。王毓等[10]以龙竹为原料，采用微波辅助水热处理制备XOS，在反应温度为180 ℃时，XOS产率为31.4%，较单独的水热预处理产生的单糖和副产物更少。Zhang等[11]研究发现，甘蔗渣在200 ℃条件下自水解反应10 min，XOS产率为50.4%，引入乙酸辅助甘蔗渣自水解，XOS混合物的平均聚合度明显降低，低聚合度XOS(聚合度2～5)的产量达到53.0%。竹材具有资源丰富、生长快、周期短等特点，且竹材的固碳量与生物量高于热带雨林植物，其作为生物质炼制技术的原料拥有巨大的发展潜力[6,12]。本研究以贵州慈竹为原料，考察了不同预处理强度下，竹材中的纤维素、半纤维素和木质素的物理和化学结构变化，探讨预处理强度系数对酶解效果和XOS得率的影响，以期为竹材类生物质资源的高效利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

慈竹由贵州赤天化纸业股份有限公司提供。竹材主要组成(以质量分数计)：葡聚糖44.5%、木聚糖15.8%、阿拉伯糖3.7%、木质素29.1%和苯醇抽提物5.9%。纤维素酶(诺维信CTec2)和木聚糖酶(诺维信c2753)，均购于Sigma-Aldrich(上海)公司，酶活力分别为250 FPU/g和174.5 U/g。

JWP50双螺杆挤出机，江苏金沃机械有限公司；GNM300盘磨，北京春晖机械有限公司；Advanced D8X射线衍射(XRD)仪、TENSOR27傅里叶红外光谱(FT-IR)仪，德国布鲁克公司；Agilent 1260系列高效液相色谱(HPLC)仪、Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱、示差折光检测器，美国安捷伦科技公司。

1.2 水热预处理

竹片首先经自来水浸泡过夜，对浸泡后的竹片进行双螺杆挤压以破碎竹细胞，从而减小物料尺寸；经过双螺杆挤压的物料再次进行盘磨处理，磨盘间距为0.2 mm。经过处理的竹纤维尺寸约为1～2 mm。

竹材水热预处理在甘油油浴中进行(含有10个1 L的反应罐)。将50 g绝干竹纤维置于反应罐中，按固液比1 ∶10(g ∶mL)加入去离子水。密封油浴罐，将其置于油浴中，之后按1 ℃/min升温至180 ℃，并分别保温20、40、60、80、100和140 min。预处理结束后，依次将反应罐取出，并迅速置于冷水中降至室温。预处理物料和预水解液用滤袋分离，置于4 ℃冰箱中储藏、备用。竹材水热预处理时，温度和时间对预处理的影响，最终都可通过预处理强度系数(lgR0)表示。不同预处理条件的lgR0，按式(1)计算：

(1)

式中：t—保温时间，min；T—预处理温度，℃；w—与预处理相关的活化能，取值14.75[13]。

1.3 纤维素酶水解

酶水解实验在150 mL酶解瓶中进行，每批称取2.5 g(以绝干物料计，下同)物料于150 mL酶解瓶中，加入1 mol/L 乙酸/乙酸钠缓冲液2.5 mL调节体系pH值为4.8，然后分别加入纤维素酶25 FPU/g(以纤维素质量计，下同)、木聚糖酶174.5 U/g(以半纤维素质量计，下同)和适量去离子水，使反应体系体积为50 mL。将酶解瓶置于50 ℃和150 r/min的摇床中水解72 h。酶解结束后，水解产物于10 000 r/min条件下离心10 min，取上清液测定其中的可发酵性糖(葡萄糖和木糖)浓度。预处理物料葡聚糖和木聚糖酶解率按式(2)和式(3)计算：

yc=m1×0.9/m2×100%

(2)

yh=m3×0.88/m4×100%

(3)

式中：yc—纤维素酶解率，%；m1—酶水解所得的葡萄糖质量，g；m2—预处理底物中纤维素(葡聚糖)质量，g；yh—半纤维素酶解率，%；m3—酶水解所得的木糖质量，g；m4—预处理底物中半纤维素(木聚糖)质量，g。

1.4 分析方法

1.4.1化学组分分析 葡聚糖、木聚糖、总木质素(酸溶木质素和酸不溶木质素之和)含量采用美国可再生能源实验室(NREL)标准方法测定[14]。

1.4.2物料得率及化学组分回收率 物料得率和化学组分回收率按式(4)和式(5)计算：

y=m5/m6×100%

(4)

r=m7/m8×100%

(5)

式中：y—物料得率，%；m5—预处理物料质量，g；m6—初始物料质量，g；r—化学组分回收率，%；m7—预处理物料剩余组分质量，g；m8—初始物料中组分质量，g。

1.4.3单糖含量的测定 所有可发酵糖(葡萄糖和木糖)含量均采用Agilent 1260系列HPLC仪测定，进样量10 μL，流动相为0.005 mol/L H2SO4溶液、流速0.6 mL/min，柱温55 ℃。

实验中低聚木糖(XOS)浓度采用酸水解法分析。首先离心除去预水解液中的不溶物，准确移取5 mL 离心上清液至酸水解瓶中，加入等体积的质量分数8%的H2SO4溶液，使体系酸质量分数为4%。混匀密封后，将酸水解瓶置于121 ℃下水解1 h，使体系中的XOS全部转化为单糖。水解液中的XOS质量浓度和得率由酸水解前后水解液中木糖质量浓度的差值计算得出，公式见式(6)和式(7)：

c=(c2-c1)×0.88

(6)

yx=m9/m10×100%

(7)

式中：c—XOS质量浓度，g/L；c2—酸水解后木糖质量浓度，g/L；c1—酸水解前木糖质量浓度，g/L；yx—低聚木糖得率，%；m9—预处理液中低聚木糖的质量，g；m10—原料中木聚糖的质量，g。

1.4.4XRD分析 预处理样品结晶度采用XRD仪测定，Cu Kα为发射源，入射线波长0.15 nm，配有Ni滤波片，测试过程中管压40 kV，管流40 mA。X射线发生器功率为3 kW、新型9 kW转靶，配有高速探测器D/tex-ultra。样品的相对结晶度(ICr)根据Segal提出的经验公式进行计算[15]，见式(8)：

(8)

式中：I002—002晶格的极大衍射强度；Iam—无定形区背景衍射的散射强度。

1.4.5FT-IR分析 称取水热预处理前后样品10 mg，按质量比1 ∶100加入KBr(1 g)，混合均匀。在10 MPa下对样品进行压片后进行红外分析，测试过程中，扫描波数范围为400～4000 cm-1。

2 结果与分析

2.1 水热预处理条件优化

2.1.1竹材化学组成及其回收率 竹材水热预处理温度为180 ℃，设置6个不同的预处理时间(20、40、60、80、100和140 min)，对应的预处理强度系数(lgR0)分别为3.66、3.96、4.13、4.26、4.36和4.50，未处理的竹材的强度系数为0。对原料竹材在不同预处理条件下进行水热预处理，预处理强度对竹材化学组分质量分数和组分回收率的影响如表1和图1所示。

从表1可以看出，预处理物料的葡聚糖、木聚糖及木质素质量分数均发生不同程度的变化。随着预处理强度系数的增大，预处理物料得率逐渐从100%降低至41.7%，说明在预处理过程中，物料组分发生降解。当预处理强度系数从0增至4.50时，预处理物料中木聚糖质量分数从15.8%降低至3.5%，表明水热预处理过程中，木聚糖大量降解；随着木聚糖的降解，预处理物料中木质素的含量逐渐升高，木质素质量分数从29.1%上升到34.9%，葡聚糖质量分数先升高后降低，从44.5%上升到最大值59.7%再降低至55.5%，当预处理强度系数提高至4.50 时，预处理物料中葡聚糖质量分数仅为55.5%，相比强度系数为4.36时降低了4.2个百分点，表明在较高的预处理强度下葡聚糖也会发生降解。这与Moniz等[16]研究的水稻秸秆水热预处理结果相一致，表明在水热预处理过程中主要发生的是竹材木聚糖的脱除反应，同时保留了大部分葡聚糖和木质素。

表1 水热预处理对竹材化学组分质量分数的影响Table 1 Effect of the LHWP on the mass fraction of the bamboo chemical components

由图1可知，随着预处理强度系数的增加，竹材中葡聚糖和木质素的回收率呈下降趋势，而木聚糖脱除率逐渐升高。预处理强度系数为3.66时，竹材的木聚糖脱除率为54.6%；预处理强度系数增至3.96时，木聚糖脱除率增加了18.5个百分点，达到73.1%，该结果与表1中的结果相一致，表明水热预处理中主要发生木聚糖的降解和溶解作用[17]。在水热预处理高温高压条件下，竹材半纤维素侧链的乙酰基发生脱落并与体系中的自由氢离子形成乙酸，增强了预处理反应体系的弱酸性环境，促进了物料的自水解[18-19]。当预处理强度系数超过3.96时，木聚糖的脱除率增幅变缓。

图1 预处理强度系数对化学组成的影响Fig.1 Effect of pretreatment intensity coefficiency on chemical components

2.1.2酶解效果 预处理物料的酶解效率是评价预处理效率的关键因素，对未经处理和预处理的竹材进行酶水解，并分析酶水解得率与木聚糖脱除率之间的关系，结果如图2所示。从图可知，未经水热预处理的竹材葡聚糖和木聚糖的酶解效率较低，分别仅为17.2%和27.2%。水热预处理能够显著改善预处理竹材的酶水解效率，竹材葡聚糖和木聚糖酶解得率均随着强度系数的增加而提高，当预处理强度系数从0增至4.50时，葡聚糖酶解得率从17.2%提高至79.0%，木聚糖酶解得率也从27.2%提高至92.0%。这是因为，随着预处理强度系数的增加，预处理物料中木聚糖大量降解，物料化学结构被破坏，葡聚糖因此暴露出来，增加了纤维素酶对纤维素的可及性[20]，进而提高了预处理竹材的酶水解效率。为进一步明确木聚糖脱除对纤维素酶水解的影响，本研究探讨了酶水解得率与木聚糖脱除率的关系(见图3)。从图中可以看出，葡聚糖和木聚糖酶水解得率与木聚糖脱除率之间有较强的线性关系，其R2分别为0.909和0.809，表明木聚糖的脱除确实能够有效促进葡聚糖的酶水解。

图2 预处理强度系数对酶解率的影响Fig.2 Effect of pretreatment intensity coefficiency on the enzymatic hydrolysis yield图3 木聚糖脱除率与酶解率的关系Fig.3 The correlation between xylan removal and enzymatic hydrolysis yield

2.1.3低聚木糖(XOS)得率 水热预处理过程中，大量木聚糖发生降解，并主要以低聚糖的形式存在于水解液中[21]，不同预处理体系中木聚糖降解产物XOS的浓度可见图4。

图4 预处理强度系数对XOS的影响Fig.4 Effect of pretreatment intensity coefficiency on the concentration of XOS

由图4可知，水解液中XOS浓度随着预处理强度系数的增加呈先上升后下降的趋势。当强度系数为3.96 时，水解液中XOS质量浓度最高，为8.7 g/L(得率55.3%)。XOS是一类重要益生元，能够有效促进动物肠道有益菌群的增长，进而有利于动物机体健康[22-23]，因此，XOS的高得率有助于实现竹材的高值化利用。当预处理强度系数超过3.96时，XOS浓度逐渐降低，在强度系数为4.50时，水解液中XOS质量浓度仅为0.5 g/L(得率3.1%)。这是因为随着预处理强度的增加，半纤维素逐渐降解，并以XOS的形式存在；而当预处理强度系数较高时，水解液中的XOS会继续降解，产生木糖、糠醛等物质，导致XOS浓度下降。

从图4还可看出，随着预处理强度系数的增大，木糖浓度呈先上升后下降的趋势，当强度系数为4.26 时木糖质量浓度达到最大，为3.6 g/L。表明水热预处理过程中，随着预处理强度系数的增大，部分XOS会降解为木糖，而进一步提高强度系数，木糖也会分解。由此可知，水热预处理是一种高效生产XOS的技术，然而结合2.2节酶解率最高的条件为lgR0=4.50，与XOS质量浓度最高的条件(lgR0=3.96)并不一致。因此，若利用水热预处理对竹材进行加工，如何在保证XOS得率的前提下，提高预处理物料的酶水解效率将是今后研究的重点。

2.2 物料理化性质分析

2.2.1纤维素的结构变化 纤维素是由结晶区和非结晶区交错联结构成的，纤维素结晶区占纤维素整体的百分比称为纤维素的结晶度，纤维素的结晶度是影响酶水解的重要因素之一[24-25]。为深入了解水热预处理对竹材纤维素结构的影响，测定了不同预处理强度系数下，物料纤维素结晶度的变化，并分析了纤维素结晶度与酶水解得率的关系，如图5和图6所示。

从图5可以看出，预处理后竹材纤维素结晶度呈增大趋势，原料竹材(lgR0=0)的纤维素结晶度为55.2%。当预处理强度系数逐渐提高至3.96时，竹材结晶度逐渐从55.2%至63.1%，这是因为非结晶态的半纤维素和木质素的移除使得物料纤维素结晶度升高；继续提高预处理强度系数，物料结晶度升高趋势逐渐变缓，这可能由于在较高的预处理强度下，物料中结晶区纤维素也发生少量降解所致。

图5 预处理强度系数对纤维素结晶度的影响Fig.5 Effect of pretreatment intensity coefficiency on the cellulose crystallinity

葡聚糖酶水解效率与纤维素结晶度的关系可见图6。预处理竹材的酶解得率随着结晶度的升高而升高，并且葡聚糖酶解率和结晶度间存在较强的线性关系，R2为0.807。通常认为纤维素结晶度越低，物料酶解率越高。这与Li等[26]对杨木水热预处理的研究结论相似。在水热预处理过程中，尽管预处理物料的纤维素结晶度升高，但是其木聚糖也大量降解，使得纤维素可及度增加，因而促进了纤维素酶对纤维素的水解。

图6 纤维素结晶度与酶解率的关系Fig.6 Effect of the correlation between cellulose crystallinity and glucan hydrolysis yield

2.2.2红外光谱分析 为进一步确认预处理过程中的组分变化，测定了不同预处理时间下竹材的红外图谱，结果如图7所示。

图7 竹材经不同预处理强度水热处理后的红外光谱图Fig.7 FT-IR spectra of bamboo pretreated by LHWP with different pretreatment intensity

从图7中可以看出，预处理前后样品的红外光谱图类似，均保持着原料的特征，说明预处理前后竹纤维的主要结构没有发生变化。根据FT-IR光谱确定产物的种类，与纤维素相关的特征峰在895 cm-1(糖苷键)、1034 cm-1(C—O—C伸缩振动)、2893 cm-1(C—H伸缩振动)和3331 cm-1(O—H伸缩振动)处。图中1046 cm-1附近为C—H 芳香环面内振动；836 cm-1附近为木质素中C—H平面弯曲振动吸收，水热预处理后该吸收峰减弱，可能原因是高温使得部分木质素发生降解而溶出[27-29]。与原料相比，预处理后的竹材由于半纤维素部分降解以及脱乙酰基作用，1238 cm-1处的醚键吸收峰逐渐减弱，表明在水热预处理过程中，竹纤维细胞壁中组分溶出或降解时存在醚键断裂。在植物细胞壁组成中，木质素与周围碳水化合物的链接方式包含苄基醚键和苯酯键[30]。这说明，在水热预处理中，伴随有木质素和碳水化合物的溶出，这与前述竹材水热预处理后组分变化分析结果吻合。

3 结 论

3.1随着水热预处理强度系数的增加，半纤维素(木聚糖)含量逐渐降低，而纤维素(葡聚糖)和木质素含量逐渐升高，说明在水热预处理过程中，主要发生的是木聚糖的降解。

3.2水热预处理对酶解效果影响明显，提高预处理强度系数(lgR0)可显著提高酶解率。预处理强度4.5时，葡聚糖酶解率79.0%，木聚糖酶解率92.0%，酶解率均比未处理物料提高50个百分点左右。

3.3水热预处理是一类高效制备低聚木糖的技术，低聚木糖浓度随着预处理强度系数增加呈先上升后下降趋势，并且在预处理强度系数(lgR0)为3.96时，低聚木糖质量浓度最高，为8.7 g/L(得率55.3%)；而纤维素酶水解效率最高的条件为lgR0=4.5。因此，如何在保证低聚木糖得率的前提下提高预处理物料的酶水解效率将是下一步研究的重点。