圆齿野鸦椿籽油提取工艺及脂肪酸组分分析

陈淑琴，叶燕燕，全颖萱，李林海，倪 林,*，邹双全

(1.福建农林大学 植物保护学院，福建 福州 350002；2.自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002)

圆齿野鸦椿(EuscaphiskonishiiHayata)是省沽油科野鸦椿属植物[1]，为我国珍贵的观赏兼药用树种，其果皮、枝条、叶片和种子的醇提物均具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用[2-3]。近年来，圆齿野鸦椿人工种植面积不断扩大，仅福建地区种植面积就达300公顷以上，植物资源丰富[4]。但针对圆齿野鸦椿籽的研究较少，成分方面的研究多集中于三萜类、酚酸类化合物[5-7]，而含量丰富的油脂类成分却未见报道。本课题组一直致力于圆齿野鸦椿籽的植物资源开发与利用[8-11]，研究前期发现种子的含油率在5%以上，且油中含有的人体必需不饱和脂肪酸含量较高，有较好的开发前景。响应面法是一种通过对响应曲面以及等高线的分析来优化反应条件和最佳加工工艺参数的方法，采用多元二次回归方程对响应值与多因素试验的因素进行函数关系拟合，对不同参数进行评价以减少试验次数[12-14]。为了进一步明确圆齿野鸦椿籽的含油量及脂肪酸组成，本研究采用响应面法优化正己烷回流提取圆齿野鸦椿籽油的提取工艺，并分析油中脂肪酸组成，以期为圆齿野鸦椿籽油的进一步开发利用提供理论依据。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

样品采自福建省三明市尤溪县洋中镇人工培育的4～5年生的圆齿野鸦椿成熟种子；福建农林大学邹双全教授鉴定为省沽油科野鸦椿属圆齿野鸦椿(EuscaphiskonishiiHayata)，采摘时间为2018年11月，留样保存于福建农林大学植物保护学院制药工程系。试剂正己烷、乙醚、石油醚、盐酸、氢氧化钠、甲醇均为分析纯。安捷伦7890A气相色谱仪，安捷伦科技有限公司；CD-2560毛细管色谱柱(100 m×0.25 mm×0.20 μm)。

1.2 圆齿野鸦椿籽油脂的回流提取

将圆齿野鸦椿籽烘干至质量恒定，粉碎后取粒径0.075 mm部分备用，精密称取5 g的样品粉末置于250 mL圆底烧瓶中，加入一定体积的正己烷，置于一定温度下的恒温水浴锅中回流一定时间，提取液趁热抽滤，滤液于旋转蒸发器中旋转蒸发得到油脂，称定其质量，并按下式计算油脂提取得率:

1.3 单因素试验

1.3.1提取时间的影响 固定正己烷-样品粉末比例(液料比)10 ∶1(mL ∶g，下同)，提取温度为70 ℃，提取时间分别为30、45、60、75和90 min，按1.2节方法进行试验。

1.3.2提取温度的影响 固定液料比10 ∶1，提取时间为60 min，提取温度分别为50、60、70、80、90和100 ℃，按1.2节方法进行试验。

1.3.3液料比的影响 固定提取时间为60 min，提取温度为80 ℃，液料比分别为6 ∶1、8 ∶1、10 ∶1、12 ∶1、14 ∶1、16 ∶1，按1.2节方法进行试验。

1.4 响应面试验

通过单因素试验得出提取时间(X1)、提取温度(X2)和液料比(X3)3个因素的水平值，以提取得率为响应值，运用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken响应面设计及数据分析，共设计17个试验，其中心点重复试验5次。

通过响应面分析得到回流提取圆齿野鸦椿籽油的最佳工艺条件，并按照最佳工艺条件重复试验3次，以验证响应面法所得结果的可靠性。

1.5 圆齿野鸦椿籽不同部位油脂得率及成分分析

1.5.1油脂提取得率 称取50 g圆齿野鸦椿籽，用刀片分离种皮与种仁，按照1.2节方法分别对样品进行油脂回流提取后进行验证性实验，得出圆齿野鸦椿种皮与种仁的油脂提取得率。

1.5.2油脂成分

1.5.2.1前处理方法 称取优化条件下提取的圆齿野鸦椿籽油、种仁油和种皮油各约0.1 g，加入100 mg焦性没食子酸，加入几粒沸石，再加入2 mL 95%乙醇，混匀。加入12 mol/L盐酸溶液10 mL，混匀；将烧瓶放入70～80 ℃水浴中水解40 min。每隔10 min振荡一下烧瓶,使黏附在烧瓶壁上的颗粒物混入溶液中；水解完成后，取出烧瓶冷却至室温。向水解后的试样中加入10 mL 95%乙醇,混匀；将水解液转移到分液漏斗中,用50 mL乙醚石油醚混合液(体积比1 ∶1)冲洗烧瓶和塞子,冲洗液并入分液漏斗中,加盖，振摇5 min，静置10 min；将醚层提取液收集到250 mL烧瓶中，按照以上步骤重复萃取水解液3次,最后用乙醚石油醚混合液冲洗分液漏斗,并收集到已质量恒定的烧瓶中，将烧瓶置水浴上蒸干，置烘箱中干燥2 h。干燥的提取物继续加入2 mL 2%氢氧化钠甲醇溶液，85 ℃水浴锅中水浴30 min，加入3 mL 14%三氟化硼甲醇溶液，继续水浴30 min；然后降到室温，在离心管中加入1 mL正己烷，振荡萃取2 min之后，静置1 h，等待分层；取上层清液100 μL，用正己烷定容到1 mL；用0.45 μm滤膜过滤后采用气相色谱测试。

1.5.2.2色谱条件 升温程序：130 ℃保持5 min，以4 ℃/min 的速率升温至240 ℃，保持30 min。色谱柱CD-2560(100 m×0.25 mm×0.20μm)；进样口温度250 ℃；载气流速0.5 mL/min；分流进样，分流比10 ∶1；检测器FID；检测器温度250 ℃。

1.5.2.3计算公式 试样中各脂肪酸的质量分数按公式计算：

式中：W—试样中各脂肪酸的质量分数，%；C—试样测定液中脂肪酸甲酯的质量浓度，mg/L；V—体积，mL；k—各脂肪酸甲酯转化为脂肪酸的换算系数；N—稀释倍数；m—试样的称样质量，g。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1提取时间对提取得率的影响 由图1(a)可知，随着提取时间的延长，籽油的提取得率先呈上升趋势，在60 min时达到峰值(提取得率5.57%)，继续延长提取时间，部分正乙烷在提取前挥发，提取得率下降，时间越长，溶剂挥发越多，提取得率越低。故选取60 min为最优回流提取时间。

2.1.2提取温度对提取得率的影响 由图1(b)可知，随着提取温度的升高，反应速率增大，分子热运动加快，籽油的提取得率先呈上升趋势，在80 ℃时达到峰值(提取得率5.83%)，继续提高提取温度，温度过高，成分被破坏，杂质溶出提取得率下降，故选取80 ℃为最优回流提取温度。

2.1.3液料比对提取得率的影响 由图1(c)可知，正己烷-样品粉末比(液料比)越大，即溶剂用量越大，油脂的提取率先增大后减小。在液料比10 ∶1时达到峰值(提取得率5.83%)，籽油已基本提取完全，继续增大液料比，提取得率下降，结合提取效果与提取成本，最佳液料比为10 ∶1。

a.提取时间extraction time；b.提取温度extraction temperature；c.液料比值ratio of solid to liquid图1 提取条件对提取得率的影响Fig.1 Effects of extraction conditions on extraction yield

2.2 响应面分析

2.2.1响应面回归模型建立与方差分析 响应面试验结果见表1,利用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行二次多项式回归拟合，得到油脂的提取得率(Y)与提取时间(X1)、提取温度(X2)、液料比值(X3)的回归方程，对回归方程进行方差分析，结果见表2。

表1 响应面试验设计与结果Table 1 Design and results of response surface test

表2 响应面方差分析Table 2 Analysis of response surface variance

2.2.2响应曲面图分析 图2为各因素对提取得率影响的响应曲面图。由图2(a)可以看出，提取时间与提取温度对于籽油提取得率的交互作用极显著,当提取时间为60 min、提取温度为80 ℃时，提取得率达到最大，由等高线图可知，提取时间相比于提取温度而言，对提取得率的影响更为显著。从图2(b)可以看出，提取时间与液料比对于籽油提取率的交互作用不显著,当提取时间为60 min、、液料比为10 ∶1 时油脂的提取得率达到最大。由图2(c)可知提取温度和液料比对于籽油提取率的交互作用显著,当提取温度为80 ℃，液料比为10 ∶1时提取得率达到最高。从等高线图可知，提取温度对提取得率的影响比液料比更为显著。

2.2.3验证实验 通过响应面分析得到回流提取圆齿野鸦椿籽油的最佳工艺条件为提取时间62.08 min,提取温度80.2 ℃，液料比10.14 ∶1，该条件下提取得率的预测值为5.84%。为验证响应面法所得结果的可靠性，试验3次，提取得率分别为5.849%、5.852%和5.851%，平均提取得率为5.851%，相对标准偏差(RSD)值为0.005%。验证试验籽油提取得率为(5.85±0.001)%，与预测值接近，两者的相对误差为 0.17%，表明响应面法建立的回归模型与真实试验结果拟合程度较高，优化的工艺条件可靠。

2.3 圆齿野鸦椿籽不同部位油脂测定结果

2.3.1油脂提取得率 圆齿野鸦椿籽中，种仁占比为(14.0±0.01)%，油脂提取得率为(35.6±0.7)%，出油率与核桃油[15]相当；种皮占比为(84.4±0.02)%，油脂提取得率仅为(2.1±0.15)%。

2.3.2成分分析 采用GB 5009.168—2016中的方法，检测圆齿野鸦椿籽油中各脂肪酸组成,同时对种仁油与种皮油进行气相色谱分析(见图3)。

从圆齿野鸦椿籽油中检出脂肪酸成分18种，分别为十四碳酸甲酯(0.04%)、十五碳酸甲酯(0.02%)、十六碳酸甲酯(6.68%)、顺-9-十六碳-烯酸甲酯(0.08%)、十七碳酸甲酯(0.22%)、顺-10-十七碳-烯酸甲酯(0.07%)、十八碳酸甲酯(5.53%)、顺-9-十八碳-烯酸甲酯(18.54%)、顺，顺-9，12-十八碳-二烯酸甲酯(45.64%)、二十碳酸甲酯(0.30%)、顺-11-二十碳-一烯酸甲酯(0.34%)、顺，顺，顺-9，12，15-十八碳-三烯酸甲酯(0.56%)、顺，顺-11，14-二十碳-二烯酸甲酯(0.07%)、二十二碳酸甲酯(0.05%)、顺-5，8，11，14-二十碳-四烯酸甲酯(0.04%)、二十三碳酸甲酯(0.02%)、二十四碳酸甲酯(0.06%)和顺-15-二十四碳-一烯酸甲酯(0.18%)。脂肪酸总检出率为78.44%，其中，不饱和脂肪酸的量为65.52%；饱和脂肪酸的量为12.92%；含量前3的成分依次为顺，顺-9,12-十八碳-二烯酸甲酯(亚油酸)、顺-9-十八碳-烯酸甲酯(油酸)和十六碳酸甲酯(硬脂酸)，其中亚油酸的量高达45.64%，与芝麻油[16]相当，显示出良好的市场开发前景，这将为圆齿野鸦椿籽油的开发与利用提供理论依据。

3 结 论

3.1以圆齿野鸦椿籽为原料，以正己烷作为提取试剂，回流提取圆齿野鸦椿籽油。在单因素试验基础上，通过响应面法优化提取条件，结果得出的最佳工艺条件为：提取时间62.04 min,提取温度80.2 ℃，液料比10.14 ∶1，该条件下籽油的提取得率为5.85%，提取得率的预测值和验证实验值接近，拟合程度较高，优化的工艺条件可靠。

3.2圆齿野鸦椿籽中，种仁占比为(14.0±0.01)%，油脂提取得率为(35.6±0.7)%；种皮占比为(84.4±0.02)%，油脂提取得率仅为(2.1±0.15)%。从圆齿野鸦椿籽油中检出脂肪酸成分18种，其中，不饱和脂肪酸的量为65.52%。含量最多的3种脂肪酸为亚油酸、油酸、硬脂酸，且亚油酸的量高达45.64%。