漆酶/介体体系降解单一纸浆树脂模拟物的研究

覃发兴，孟婷婷，马乐凡*，张旭桃，李洪兵

(1.长沙理工大学 化学与生物工程学院，湖南 长沙 410114；2.国家生活用纸产品质量监督检验中心，湖南 常德 415001；3.湖南鸿鹰生物科技有限公司，湖南 常德 415400 )

树脂是植物纤维原料中存在的一类亲脂性化合物，约占原料总量的2%～8%，其化学组成比较复杂，主要包括甘油三酯、脂肪酸、树脂酸、甾醇、萜烯和烷烃等。在造纸生产的制浆和打浆过程中，残留于木材薄壁细胞和树脂道中的树脂会进入浆水体系，形成胶体状树脂[1-3]；这些胶状物能絮聚形成大颗粒，沉积在设备和产品上，影响制浆造纸设备的正常运行和使用寿命，增加停机清洗的次数，影响生产操作的正常进行，并降低产品产量和质量[4-5]。目前，控制纸浆树脂障碍的措施主要包括：增加原料贮存过程中树脂类物质自然风化和生物降解，以及对制浆造纸生产过程中的树脂采用物理控制法、化学控制法和生物控制法来分解并脱除。生物控制法中的生物酶处理与制浆造纸生产过程和环境的兼容性好，能够有效地降解树脂成分，不影响产品质量和设备的运行是纸浆树脂障碍控制技术研究的热点[6-8]。可以用于纸浆树脂控制的生物酶主要包括：漆酶[9-12]、脂肪酶[13-14]、磷脂酶[15]、甾醇酯酶和脂氧合酶等[16]。其中，脂肪酶已广泛应用于控制高得率浆的树脂障碍，但它主要是水解纸浆树脂中的甘油酸酯，其应用和效果有较大的局限性；甾醇酯酶的水解产物具有较强的黏性，仍然容易形成树脂沉积，磷脂酶和脂氧合酶对纸浆中树脂的水解和氧化效率较低，因此，这3类酶的研究较少。漆酶是一种含铜的多酚类氧化酶，可催化降解酚及其衍生物、羧酸及其衍生物、甾醇及其衍生物、芳胺及其衍生物、金属有机化合物等多类有机物[17-18]，是降解纸浆中树脂的理想生物酶。由于漆酶的特异性比较强，大量的底物不能直接与之结合，通过漆酶的氧化还原电位比较低，不能直接作用于高氧化还原电势的底物。研究发现，小分子介体是一些低相对分子质量、低氧化还原电势的化合物，容易得失电子，能在漆酶的作用下形成活性高且稳定的中间体，并作用于各种底物。目前常用的漆酶介体分为人工合成介体和酚类天然介体两大类，其中，人工合成介体(HBT、ABTS等)的研究较早较多，与漆酶形成的体系的氧化能力较强，但价格昂贵且具有潜在的毒性；酚类天然介体(丁香醛、乙酰丁香酮等)的来源广泛，价格较低且与环境的兼容性好，但是体系的氧化能力相对较低，因此，研发高效、廉价、环保的介体是漆酶大规模产业化应用急需解决的问题之一。本研究采用一种产自黄孢原毛平革菌的漆酶，对纸浆中的树脂模拟物进行降解，重点筛选了该漆酶的介体，对比了漆酶/介体体系对单一树脂模拟物(松香酸、亚油酸、油酸、β-谷甾醇、甾醇油酸酯)的降解率，探讨了漆酶降解亚油酸和油酸的动力学，并优化了漆酶/介体体系降解亚油酸的工艺条件，以期为纸浆树脂障碍控制技术研究提供基础数据。

1 实 验

1.1 材料与试剂

漆酶，湖南鸿鹰生物科技有限公司，产自黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)的液体酶。实验室测得该漆酶的酶活为850 U/mL，pH值4.0时其酶活最大。

亚油酸、油酸、松香酸、β-谷甾醇和甾醇油酸酯，均为标准品；丁香醛、乙酰丁香酮、醋酸钠、冰醋酸和吡啶，均为分析纯。2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、1-羟基苯并三唑(HBT)，酷尔化学科技北京有限公司；N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(98%干度)，上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 漆酶/介体体系对树脂模拟物的降解

1.2.1纸浆中树脂模拟物溶液的制备 用丙酮为溶剂，分别加入亚油酸、松香酸、油酸、β-谷甾醇、甾醇油酸酯，配制成8 g/L树脂模拟物/丙酮溶液；分别取一定量的树脂模拟物/丙酮溶液，加入到pH值4.0的醋酸/醋酸钠缓冲溶液中，用旋涡振荡混合器混合，分别配制成质量浓度为500 mg/L的纸浆树脂模拟物。

1.2.2漆酶介体的筛选 分别用HBT、ABTS、丁香醛、乙酰丁香酮作为介体，在介体用量、酶用量、温度、pH值和时间一定的条件下用漆酶处理亚油酸树脂模拟物，反应过程中用空气泵向反应液中充氧。分别用气相色谱(GC)分析处理前和处理后的反应液，用归一化法计算亚油酸的峰面积[19]，用公式(1)计算亚油酸树脂模拟物的降解率(y,%)，对比筛选出该漆酶合适的介体。

(1)

式中：C0—表示降解前树脂的峰面积；C1—表示降解后树脂的峰面积。

1.2.3对纸浆单一树脂模拟物的降解 在酶用量、介体用量、时间、温度、pH值一定和通空气的条件下，用漆酶/介体体系分别处理松香酸、亚油酸、油酸、β-谷甾醇和甾醇油酸酯5种树脂模拟物。分别用GC分析处理前和处理后的反应液，用公式(1)计算出5种树脂模拟物的降解率，并进行对比分析。

1.3 降解动力学研究

在酶用量、介体用量、时间、温度、pH值一定和通空气的条件下，用漆酶/介体体系分别处理亚油酸和油酸树脂模拟物。改变2种底物的浓度，通过测定漆酶/介体体系在30 min内对各个浓度的亚油酸和油酸树脂模拟物的降解率，求出不同底物浓度下([S])酶解反应初速度(v0)，然后以1/[S]为横坐标、1/v0为纵坐标绘制Lineweaver-Burk图，计算出漆酶与亚油酸和油酸反应的米氏常数(Km)，并分析亚油酸和油酸的Km对其降解率的影响[20]。米氏方程可见式(2)：

(2)

式中：v0—反应初速度，μmol/(min·L)；vmax—最大反应速度，μmol/(min·L)；[S]—底物浓度，mmol/L；Km—米氏常数，mmol/L。

1.4 漆酶/介体体系降解亚油酸工艺优化

在固定介体用量、pH值和通空气的条件下，分别改变温度、时间和酶用量，用漆酶/介体体系处理亚油酸树脂模拟物，分别研究温度、时间和酶用量对亚油酸降解效率的影响，确定漆酶/介体体系处理亚油酸的合适工艺条件。

1.5 分析与检测

1.5.1漆酶酶活测定 采用ABTS法测定漆酶的酶活[21]。

1.5.2GC分析 首先对GC 分析的样品进行硅烷化处理[22]，然后取1 mL样品用7890 Plus气相色谱仪(山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司)进行分析。GC分析条件为SE-54石英毛细管柱(30 m×0.5 mm×0.25 μm)，FID检测器，进样口温度300 ℃，检测器温度350 ℃；初始柱温100 ℃保持1 min，然后以15 ℃/min 的速度升温至280 ℃，保持30 min。

2 结果与讨论

1)*:以亚油酸作树脂模拟物linoleic acid as resin simulant；:介体为HBT HBT as mediator

2.1 漆酶介体的筛选

分别用HBT、ABTS、丁香醛、乙酰丁香酮作为介体，在介体用量7.6 mol/g(以树脂模拟物的质量计，下同)、酶用量2.0 U/mg、时间60 min、温度50 ℃、pH值4.0和通空气的条件下，用漆酶/介体体系处理亚油酸树脂模拟物。同时，以漆酶单独处理和煮沸灭活漆酶作为对照组，分别用GC分析4种漆酶/介体体系及2组对照组处理前和处理后的反应液，用式(1)计算降解率，结果如表1所示。

表1 不同因素对漆酶降解树脂模拟物的影响Table 1 Effect of different factors on the degradation of resin simulants by laccase

由表1可知，在漆酶被灭活的情况下，反应前后亚油酸未被降解；在没有添加介体时，漆酶单独作用只能降解30.9%的亚油酸；而在反应液中加入介体后，漆酶降解亚油酸的效率提高。这是因为漆酶是单电子氧化酶，其氧化还原电位低，氧化能力弱，而介体在漆酶的作用下会形成活性高且有一定稳定性的中间体，这些中间体能从氧分子中获得电子，并传递给底物，从而提高了系统的氧化还原电位，可加快反应速度，提高底物降解效率，并且介体的加入可以进一步扩大氧化底物的范围[11]。因为不同漆酶介体体系与底物的作用机制不同，使其氧化降解底物的效率存在差异[23]，在研究的4种介体中，漆酶/HBT体系处理亚油酸的降解率为88.9%，远高于其他3种介体；漆酶/ABTS的体系对亚油酸的降解效率为46.8%，略高于2种天然介体体系丁香醛的45.1%和乙酰丁香酮的43.2%。因此，选择HBT作为介体比较合适。

2.2 漆酶/HBT对树脂模拟物的降解

在酶用量2.0 U/mg、HBT用量7.6 mol/g、时间60 min、温度50 ℃、pH值4.0和通空气的条件下，用漆酶/HBT体系分别处理松香酸、亚油酸、油酸、β-谷甾醇、甾醇油酸酯5种树脂模拟物。5种树脂模拟物处理前和处理后的GC-MS分析结果如图1所示，漆酶/HBT体系对5种树脂模拟物的降解率亦如表1所示。

1.处理前untreated；2.处理后treateda.松香酸abietic acid;b.亚油酸linoleic acid;c.油酸oleic aicd;d.β-谷甾醇β-sitosterol;e.甾醇油酸酯sterol oleate图1 漆酶/HBT体系降解树脂模拟物GC图Fig.1 GC analysis of degradation pitch model compounds by laccase/HBT system

从表1可知，漆酶/HBT体系对松香酸、亚油酸、油酸、β-谷甾醇、甾醇油酸酯5种树脂模拟物的降解率分别为100%、88.9%、81.5%、49.0%、33.6%，对松香酸的降解率最高，对不饱和脂肪酸的降解率次之，对甾醇和甾醇酯的降解率最低。从树脂模拟物的分子结构上分析，松香酸是一种三环二萜类化合物，含共轭双健，其电子密度大，稳定性差，易于与漆酶/HBT体系结合而被氧化降解，因此比亚油酸、β-谷甾醇等树脂成分更容易被降解；而甾醇是一类由3个己烷环及1个戊烷环稠合而成的环戊烷多氢菲衍生物，稳定性较好，更难与漆酶/介体体系结合，因此，β-谷甾醇和甾醇油酸酯难以被漆酶氧化。漆酶/HBT体系对底物降解效率的差异主要与其与漆酶/HBT体系结合的难易程度相关，底物越易于与介体自由基结合时，它就越容易被降解[23]。

亚油酸和油酸均含有不饱和双键，比较容易被漆酶氧化降解。Zhang等[7]提出漆酶氧化亚油酸的过程，大致如下几步(如图2所示)：在漆酶的作用下，亚油酸C11上的H原子被提取，形成了自由基结构，该自由基受到空气中的氧原子攻击，形成过氧自由基，然后，经过一系列的链式反应，H原子不断被提取出来，形成氢过氧化物，最终形成醛、醇以及酮类物质。

图2 漆酶/HBT体系降解亚油酸反应过程Fig.2 Mechanism of linoleic acid degradation by laccase/HBT system

2.3 亚油酸和油酸降解动力学

在酶用量1.0 U/mL、介体浓度3.8 mmol/L、时间30 min、温度50 ℃、pH值4.0和通空气条件下，用漆酶/HBT体系分别处理亚油酸和油酸。在底物浓度为0.59、1.19、1.77和2.36 mmol/L的条件下，分别测定了漆酶氧化亚油酸、油酸反应的初速度(见表2)，采用Lineweaver-Burk双倒数法绘制曲线(见图3)得到方程分别为：y=35.534 0x+2.583 6(R2=0.998 1)和y=37.278 6x+2.006 8(R2=0.998 9)。

表2 不同底物浓度下的反应初速度Table 2 Initial reaction rate under differernt substrate concention

由图3中Lineweaver-Burk图的斜率和截距，可求出漆酶/HBT体系在底物为亚油酸、油酸条件下的米氏常数(Km)分别为1.38和1.86 mmol/L。Km值小，表示用很低的底物浓度即可达到最大的反应速度的一半，说明酶与底物的亲和力大，而酶与底物的亲和力越大，酶促反应越易进行，即亚油酸与漆酶/HBT体系的亲和力比油酸更强，更易与漆酶介体体系结合而被降解。同时，2种底物的Km与制浆造纸生产过程浆水体系中树脂的浓度0.17～1.82 mmol/L范围吻合，生产过程中需根据浆水系统的树脂成分和浓度、生产系统的温度和pH值等条件和要求的不同对酶用量等工艺参数进行优化。

a.亚油酸linoleic acid；b.油酸oleic acid图3 漆酶/HBT对不同底物的Lineweaver-Burk双倒数图Fig.3 Lineweaver-Burk of laccase/HBT system of different substrates

2.4 漆酶/HBT降解亚油酸的工艺优化

2.4.1温度对降解率的影响 在酶用量2.0 U/mg、HBT用量7.6 mol/g、时间60 min、pH 值4.0和通空气的条件下，探讨了不同温度对漆酶/HBT体系降解亚油酸的影响，结果如图4(a)所示。

由图4(a)可知，漆酶/HBT体系处理以亚油酸树脂模拟物时，降解率随温度的升高先增加后降低，在温度50 ℃时降解率达到最大值88.9%。因此，合适温度为50 ℃。

2.4.2酶用量对降解率的影响 在HBT用量7.6 mol/g、时间60 min、温度50 ℃、pH值4.0和通空气的条件下，探讨不同酶用量对漆酶/HBT体系降解亚油酸的影响，结果如图4(b)所示。

由图4(b)可知，树脂模拟物亚油酸的降解率随着漆酶酶用量的增加先快速提高，然后趋于平缓。当酶用量从0.5 U/mg增加至2.0 U/mg时，亚油酸的降解率从59.95%增加到88.9%，增加量大；当酶用量从2.0 U/mg继续增加到4.0 U/mg时，亚油酸的降解率从88.9%增加到100%，亚油酸可以被漆酶完全降解。综合考虑生产成本和降解效率，漆酶用量在2 U/mg比较合适。

2.4.3时间对降解率的影响 在酶用量2.0 U/mg、HBT用量7.6 mol/g、温度50 ℃、pH值4.0和通空气的条件下，探讨不同反应时间对漆酶/HBT体系降解亚油酸的影响，结果如图4(c)所示。

由图4(c)可见，随着反应时间的增加，亚油酸的降解率先迅速增加，随后逐渐变慢。当反应时间从15 min增加到60 min时，亚油酸的降解率从39.8%快速增加到88.9%；继续延长反应时间到120 min时，降解率从88.9%缓慢增加到100%，亚油酸完全被降解。因此，漆酶/HBT体系处理亚油酸的时间以60 min比较合适。

a.温度temperature；b.酶用量enzyme dosage；c.时间time图4 不同工艺条件对漆酶/HBT体系降解亚油酸效率的影响Fig.4 Effect of different conditions on degradation efficiency of linoleic acid by laccase/HBT system

3 结 论

3.1比较了漆酶与HBT、ABTS、丁香醛和乙酰丁香酮4种介体组成的漆酶/介体体系对亚油酸树脂模拟物的降解效率，其中漆酶/HBT体系降解亚油酸的效率最高。

3.2漆酶/HBT体系对松香酸的降解率最高，对不饱和脂肪酸的降解率次之，对甾醇和甾醇酯的降解率最低。

3.3漆酶/HBT体系处理亚油酸、油酸的米氏常数分别为1.38和1.86 mmol/L，表明亚油酸更易与漆酶/HBT体系结合。

3.4用漆酶/HBT体系处理亚油酸的最佳处理条件为酶用量2.0 U/mg、HBT用量7.6 mmol/mg、时间60 min、温度50 ℃、pH 值4.0，该条件下亚油酸的降解率为88.9%；当酶用量增加到4.0 U/mg或者处理时间延长至120 min，降解效率可达到100%。