乳腺癌耐药细胞株外泌体中small RNA表达分析*

洪晓绿 黄小华程 璐 赖金国 潘小平，#

外泌体(Exosome)是一种直径为40-100nm 的盘状囊泡，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，囊泡内包含多种蛋白质类型，包括细胞表面受体、胞浆信号蛋白、代谢酶、细胞骨架成分和核蛋白，也含有RNA转录物、长链非编码RNA、小分子RNA(small RNA)等[1]。Small RNA包括微小RNA(miRNA)、转运RNA来源的小RNA(tRNA-derived small RNAs, tsRNA)、与Piwi蛋白相作用的RNA(Piwi-interacting RNA, piRNA)和干扰小RNA(small Interfering RNA, siRNA)等。外泌体携带small RNA在许多疾病和肿瘤中发挥重要作用[2-4]，包括乳腺癌[5]，外泌体携带small RNA还能介导乳腺癌细胞的耐药性[6]，但对其影响乳腺癌耐药机制的研究大部分集中在miRNAs[7]。鉴于此，本文检测乳腺癌细胞株和乳腺癌耐药细胞株外泌体中small RNA表达的差异，旨在为研究外泌体携带small RNA在乳腺癌耐药机制中的作用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人乳腺癌上皮细胞系MCF-7/S和乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(上海，中国)，上述细胞株复苏后分别置于含10% 胎牛血清(Hyclone，美国)和10%青霉素-链霉素(Gibco，澳洲)的RPMI-1640 (Gibco，澳洲)培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时，用0.25%胰酶消化细胞，按1∶3的量进行细胞传代，将细胞分别接种于6孔板(3×105个/孔)内，取处于对数生长期的细胞用于后续实验。

1.2 外泌体提取

取对数生长期的MCF-7/S细胞株和MCF-7/ADR细胞株(4×105个/孔)，在无血清的RPMI-1640 培养基中过夜培养，24h后当细胞融合率达到80%-90%时收集上清，4℃ 2 000g离心20min除去细胞碎片，收集离心后的上清4℃ 10 000g高速离心1h后，用不含血清RPMI-1640 培养基悬浮沉淀，再重复之前的高速离心步骤一次[8]，弃上清，沉淀即为外泌体，于-80℃保存待用。……