CoCl2胁迫下青稞苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与表达分析

乔 枫 张 丽 耿贵工 陈 志 曾 阳 谢惠春

(1.青海师范大学 青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，西宁 810008；2.青海大学 农林科学院，西宁 810016)

青稞(Hordeumvulgarevar nudum)是青藏高原地区种植的一种重要农作物，可以作为西藏自治区和青海省农牧民的主食。与其他植物相比青稞抗逆能力较强，如抗旱、抗盐碱、抗冷、抗寒和抗病等[1-3]。青稞基因组中蕴藏着大量的抗逆基因，其独特的遗传基础、生理功能和次生代谢产物逐渐成为学者研究极端逆境的首选植物或农作物材料[1-3]。青稞的抗逆作用是受到多方面调控的，在逆境下可以通过生理代谢调节，如渗透调节、生长发育调节，来抵抗不良环境。也可以通过基因表达调节，如通过转录因子、抗逆基因的诱导表达对逆境作出响应。前人已从植物生理生化和分子生物学方面探讨青稞抗逆境机制[4-6]。本研究探索在钴胁迫下青稞幼苗相关抗逆基因的表达变化，为青稞的抗重金属机制提供线索和科学依据。

钴易被植物根系吸收，能够在植物的不同组织中如根、茎中积累，影响植物的生长发育，超过一定浓度后，钴会抑制植物的生长甚至引起植物死亡[7]。我国大部分地区的土壤钴含量为5～40 mg/kg，钴含量平均背景值为11.6 mg/kg[8]。当植物体内的Co2+过高时，严重损伤植物细胞的膜结构和代谢酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽合成酶(GSH)等活性，植物会因毒害而死亡[9-10]。小麦遭受Co2+胁迫后，施用生物炭可调节细胞内抗氧化酶活性和抗坏血酸-谷胱甘肽循环，可以最大限度地减少Co2+诱导的氧化损伤[11]。通过转录组学及microRNA测序研究钴胁迫下垂柳的基因表达和生理生化指标的变化，结果发现， 100 μmol/L 的钴胁迫植株的叶片枯黄、根系生长受阻、POD和SOD活性升高，过氧化氢酶(CAT)活性降低；转录组序列分析发现钴胁迫的植物根部有1 165 个差异基因和62个差异表达microRNA，地上部分组织中有836个差异基因和80个差异表达microRNA[12]。植物如何降低或减弱Co2+的毒害作用，是农作物抗逆生理研究的热点之一。目前，青稞幼苗响应钴胁迫分子机制的研究尚未见报道。本研究设置不同浓度Co2+处理，分析青稞‘昆仑15号’幼苗中抗逆相关的过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、谷胱甘肽合成酶(GSH)、Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)和超氧化物歧化酶(SOD)的基因表达差异，旨在阐明青稞植株抗氧化酶基因对Co2+胁迫的生理响应机制，以期为青稞的抗Co2+栽培和育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试青稞品种为‘昆仑15号’，由青海大学农林科学院作物所提供。

挑选无病虫害的种子，先用水冲洗3次，再用2%的次氯酸钠消毒3 min，后用去离子水洗2～3次。在直径为20 cm的培养皿中铺放2层滤纸，将灭过菌的青稞种子均匀地分散在培养皿的滤纸上，每个培养皿放50粒种子，置于光照培养箱中，温度为28 ℃，每天定时定量用去离子水处理，保持一定的湿度。持续处理8 d，待青稞幼苗长出2片子叶，选取长势一致的幼苗用于氯化钴溶液处理。

将氯化钴(分析纯)配置成30、70、100、150、200和250 mg/L的6个Co2+处理浓度，用6种处理液对青稞幼苗继续处理培养，对照用去离子水处理，每天定时定量处理。持续处理7 d，取样用于分析幼苗相关逆境基因的表达变化。

1.2 青稞总RNA的提取及cDNA的合成

青稞幼苗叶片总RNA的提取选用Tiangen生化公司(北京)公司的植物总RNA提取试剂盒，cDNA的第一链的合成选用TaKaRa公司的PrimeScriptTM1st strand cDNA synthesis，琼脂糖PCR产物的测序选用TaKaRa公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒，PCR产物连接到克隆载体pGEM-T easy(美国Promega公司) 及测序、引物合成由上海桑尼生物科技有限公司完成。在线Primer 3.0 软件设计引物，引物序列，见表1。

1.3 序列的生物信息学分析

采用 DNAstar 软件拼接基因测序结果，得到青稞PAL基因的全长cDNA序列。序列Blast相似性比对在NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上分析，ORF 的查找和核苷酸的翻译在软件 ORF Finder (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html) 上进行，PAL基因编码的蛋白质的结构特点和结构性质等在ExPASy(http:∥www.expasy.org)上分析，多种植物PAL的氨基酸序列的多重比对由Mega 3.1软件Clustal X (1.83)完成，系统发育树采用最小进化法(Minimum Evolution)构建。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 引物设计

选用28SrRNA作为参比基因，同时设置灭菌超纯水为阴性对照。根据NCBI网站里大麦(Hordeumvulgare)的超氧化物歧化酶基因(SOD)、Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因(P5CS)、苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)、过氧化物酶基因(POD)、谷胱甘肽合成酶基因(GSH)、28SrRNA基因序列，设计引物在Primer 3.0完成，合成引物由上海桑尼生物科技有限公司完成，引物序列见表1。

1.5 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量 PCR 方法采用 SYBR®Premix Ex TaqTM(TaKaRa 公司)试剂盒。PCR 扩增程序为：95 ℃ 预变性 40 s；95 ℃ 变性 10 s，62～64 ℃延伸 30 s，40 个循环，荧光定量 PCR 反应结束后确认反应的融解曲线、扩增曲线和产物定量。基因的相对表达量通过2-ΔΔCt方法计算[13]。

1.6 统计分析

数据的统计学分析采用Excel 2016处理，在α=0.05水平上分析差异显著性，作图选用Sigmal Plot 14.0软件完成。

2 结果与分析

2.1 青稞PAL基因的克隆

采用电子同源克隆法，以青稞幼苗叶片RNA为模板，使用不同引物组合扩增青稞PAL基因序列，并且在NCBI网站比对分析，结果显示青稞测序结果与大麦PAL基因序列有较高的相似性。其中经PALF1/PALR1引物组合扩增、测序青稞PAL基因片段长度为1 200 bp，经PALF2/PALR2扩增的产物测序为900 bp，经PALF2/PALR3扩增的产物测序为830 bp，与预期结果一致。将获得的3个片段用DNAstar软件拼接成一个连续的序列。在此序列上设计引物组合PALF3/PALR4扩增全长序列后，经测序获得 2 142 bp 的序列(图1)。

(a)RNA提取结果;(b)PALF1/PALR1结果; (c)PALF2/PALR2结果; (d)PALF2/PALR3结果;(e)PALF3/PALR4结果. M，DL 2 000 Marker

2.2 青稞PAL基因生物信息学分析

青稞PAL基因cDNA序列为2 142 bp，其碱基序列相对应的编码氨基酸有713个。将青稞PAL的cDNA序列，命名为HvPAL基因(Genbank No. MK695675)。将青稞PAL氨基酸序列在NCBI网站上预测其功能结构域，表明HvPAL的第195～211(GTITASGDLVPLSYIA)的氨基酸是苯丙氨酸/组氨酸解氨酶的保守结构域，位于苯丙氨酸/组氨酸解氨酶的活性中心，见图2。青稞PAL氨基酸序列同时有保守的催化激活位点(第433位-N、第434位-G、第476位-H和第483～487位的HNQDV序列)，脱氨基位点(第426位-L、第427位-V和第469位-L)，这些保守的激活位点与脱氨基位点与拟南芥和烟草的PAL一致。经POSORT和Motif Scan软件分析，青稞PAL氨基酸的N-端无蛋白信号肽定位序列，推测是可溶性蛋白，在C-端序列有2个双亮氨酸基元(LL)，分别在第563～564位和第698～699位。

黄底方框中为苯丙氨酸/组氨酸解氨酶的保守结构域

2.3 青稞PAL编码蛋白与其他植物同源性比较

由图3可知，青稞与大麦、小麦和水稻等的PAL氨基酸序列相似性为90%。

对青稞PAL氨基酸序列进行三级结构预测显示，其三级空间结构中α-螺旋占93.25%；无规则卷曲和β-转角含量较少，见图4。

2.4 PAL氨基酸构建的分子系统进化树

由图5可知，本研究中的青稞PAL氨基酸序列聚在禾本科分支，与植物传统的分类结果一致。

2.5 青稞基因的表达

2.5.1青稞抗逆相关基因的表达变化

由图6(a) 可知，青稞幼苗随Co2+浓度增加其POD基因的表达升高，与对照相比，在200和250 mg/L Co2+处理下，POD基因表达分别是对照的15.1和13.2倍(P<0.05)，在 200 mg/L Co2+浓度时POD基因表达量最大，均达到显著水平；其他Co2+处理POD基因表达增加但没有达到显著水平。

30～150 mg/L Co2+处理下，青稞PAL基因表达呈逐渐增加趋势(图6(b))，在150 mg/L Co2+浓度时PAL基因表达是对照的42倍(P<0.05)，其他浓度下，PAL基因的表达量较对照没有显著差异，见图6(b)。

30～150 mg/L Co2+浓度下(图6(c))，青稞幼苗中GSH基因表达呈逐渐增加趋势；100～150 mg/L Co2+处理浓度时，GSH基因表达量较对照显著增加(P<0.05)；150 mg/L的Co2+浓度下基因表达为最高水平。其余浓度处理下，GSH基因相对表达量未达到显著水平。

青稞叶片P5CS基因表达量随着30～200 mg/L Co2+浓度增加呈逐渐升高趋势(图6(d))，其中100～200 mg/L Co2+浓度下P5CS基因表达是对照的13～27倍，达到显著水平(P<0.05)，150 mg/L Co2+浓度下达到最大值；其余浓度处理下，P5CS基因相对表达量未达到显著水平。

在30～150 mg/L的Co2+处理，SOD表达量逐步升高，在70 mg/L Co2+浓度下达到最大值，是对照的9.2倍(P<0.05)。其他Co2+浓度处理下，青稞叶片中SOD表达量与对照差异不显著，见图6(e)。

玫红色代表氨基酸相同, 深绿色代表有2种或以上氨基酸相同。方框内为PAL/HIS的保守结构域。

蓝色，α-螺旋；红色，无规则卷曲。Blue，α-helix; Red，Randon coil.

2.5.2基因表达量的相关性

由表2可知，青稞幼苗在不同Co2+浓度处理下，不同基因表达量之间的相关系数(R2)不同。在0.05水平上相关系数R2=0.754，在0.01水平上R2=0.874。PAL与GSH基因表达量呈显著正相关(R2=0.850)。GSH与P5CS(R2=0.594)、POD与P5CS(R2=0.542)、GSH与SOD(R2=0.616)均呈正相关关系，但未达到显著水平。由低到高Co2+浓度处理，青稞幼苗SOD、P5CS、PAL、POD、GSH基因表达也依次增强，共同作用以抵御和适应Co2+逆境胁迫。

图5 PAL氨基酸分子系统进化树

3 讨论与结论

植物苯丙氨酸解氨酶(PAL)是苯丙酸合成途径中的第一个酶，也是其代谢途径中的关键酶之一，植物PAL受干旱、低温、紫外线和病原物等不同因素的影响而诱导基因表达增加[14-15]。PAL活性增加可使植物抵抗不良环境或病原菌侵染的能力提高。通常可以把植物的PAL活性作为诱导抗性的一个参考指标[16-18]。本研究克隆了青稞HvPAL基因，发现该基因的氨基酸序列含有苯丙氨酸解氨酶、组氨酸裂解酶和苯丙氨酸-组氨酸裂解酶3个保守结构域。青稞PAL与大麦、小麦等的氨基酸序列相似性达90%，氨基酸序列的分子系统进化树分析表明，青稞与小麦、大麦、水稻和玉米等聚为禾本科分支，这与已有研究结果一致[19]。本研究青稞幼苗在0～150 mg/L Co2+处理下，PAL基因表达逐渐增加，在150 mg/L Co2+处理时达到最大值。综上，逆境诱导青稞PAL基因的表达来响应和抵抗Co2+的胁迫，这与丝瓜响应逆境的PAL基因表达的变化结果一致[20]。

SOD是一类重要的抗氧化酶，能够将超氧化物自由基转化为过氧化氢和分子氧，是抗氧化防御的第一道防线[21]。超氧化物歧化酶基因的表达受到转录、转录后和翻译水平上调控，在发育和应答生物或非生物胁迫中起保护植物的作用[22]。在10～40 ℃，3个落叶松超氧化物歧化酶基因(LkSOD2、LkSOD4和LkSOD6)的拟南芥转基因植株中，在盐胁迫下均表现出较高的发芽率和较长的根长[22]。LkSOD5基因可恢复拟南芥atfsd2-2突变体的浅绿色和矮化表型[22]。本研究中在30～150 mg/L的Co2+处理，SOD表达量升高，植物通过提高SOD酶的表达量来清除超氧化物自由基，降低活性氧对青稞幼苗的伤害。

小写字母表示在0.05水平的差异。

表2 钴胁迫下青稞关键酶基因相对表达量间的相关分析

在30～150 mg/L Co2+浓度处理下，与对照组相比，青稞SOD、POD、P5CS、GSH和PAL基因的相对表达量均表现为增加，但是这些抗逆基因表达的响应时间顺序不同。在200和250 mg/L Co2+处理下，P5CS和POD基因的相对表达量增加。结果显示，Co2+胁迫下青稞幼苗中多种抗氧化酶表达量升高，共同提高植物抵御逆境胁迫的能力。

Co2+胁迫下青稞叶片响应重金属胁迫的相关基因之间也存在着普遍的相关关系。PAL与GSH基因表达量的相关系数为0.850，达到显著正相关关系。PAL与P5CS、POD与P5CS、GSH与SOD、GSH与P5CS基因的相关系数分别为0.632、0.542、0.616、0.594，均为正相关关系。SOD、P5CS、PAL、POD和GSH基因的最大表达量随Co2+处理浓度的增加而依次增加，这些基因通过相互协调表达以便提高青稞幼苗对环境胁迫的响应能力，还有待进一步试验验证基因表达与逆境生理指标的关系。