大口黑鲈源迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及药敏试验*

彭钟琴，黄 璐

（广东茂名农林科技职业学院，广东 茂名 525000）

大口黑鲈（Micropterus salmoides），别名加州鲈、黑鲈，隶属于鱼纲、鲈形目、鲈亚目，棘臀鲈科、黑鲈属，原产于美国加利福尼亚，在英国、法国、南非、巴西、菲律宾、中国等国家有引种繁殖，1984年引入我国广东，后推广养殖，为纯淡水鱼类，肉食性，人工养殖摄食配合饲料，生长快、肉质细嫩，味美，有“淡水石斑”之称[1]。

迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda，Et）又称为迟钝爱德华氏菌或缓慢爱德华氏菌，属于肠杆菌科的爱德华菌属（Edwardsiella），革兰氏阴性短杆菌，可运动[2]。迟缓爱德华氏菌可引起鱼类、鸟类、爬行类和人类感染患病，是一种人-鱼共患的条件致病菌。1962年从日本鳗鱼体内首次分离得到迟缓爱德华氏菌，我国最早关于迟缓爱德华氏菌感染的案例发现于1989年在福建某养殖鳗鲡中，随后在多种养殖鱼类中检测到该菌，引起罗非鱼、胡子鲇、黄颡鱼、牙鲆等经济鱼类大量死亡，对养殖户造成巨大损失，该病原菌已严重危害我国水产养殖业的健康发展[3]。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

患病大口黑鲈采自广东省佛山市某养殖场，病鱼的主要症状为食欲下降，游动无力，反应迟钝，生殖孔发红，腹部膨大，在感染后期产生了“头穿孔”的现象。人工感染用大口黑鲈来源于广东省佛山市某养殖场。

主要试剂：革兰氏染色试剂盒、药敏纸片、Super Mix、核酸染料、DNA Maker DL2000、琼脂糖粉、细菌DNA提取试剂盒、营养肉汤营养和琼脂培养基。

1.2 病原菌分离纯化

采用无菌操作，从患病大口黑鲈的肝脏、肾脏、腹水中取样并接种于普通琼脂培养基上，在28℃下培养24h，挑取形态一致的优势单个菌落进行纯培养得到一株优势菌株SD1010。

1.3 病原菌理化特性鉴定

分离菌株接种于营养琼脂培养基中，在28℃下培养24 h，观察菌落的形态特征。取纯化菌落加入无菌生理盐水制成抹片经革兰氏染色后镜检，观察菌体形态、结构以及染色特性。将菌株SD1010接种于营养肉汤培养基中培养18 h，向各微量生化鉴定管加入80 μL菌液，在28℃培养24 h后根据反应现象进行生理生化鉴定。

1.4 病原菌16S rRNA基因序列分析

1.4.1 菌株全基因组提取

将菌株SD1010接种于营养肉汤培养基，28℃下恒温震荡培养18 h，离心收集菌液1 mL，按照DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取。

1.4.2 菌株SD1010的16S rRNA PCR测序

按照表1，进行16S rRNA PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，寄送上海生工生物工程有限公司纯化并测序。

表1 引物序列及PCR扩增反应条件

1.4.3 系统发育树构建

将测序得到菌株SD1010的16S rRNA序列在NCBI上进行BLAST比对，利用MEGA11.0软件进行多重序列比对分析，采用邻接法（Neighbor Joining Method）构建系统发育树。

1.5 人工感染试验

健康大口黑鲈于28℃下暂养一周，将70尾健康的大口黑鲈随机分为7组（6组为试验组，1组为对照组），每组10尾。将培养好的菌株SD1010用无菌生理盐水制成菌悬液，调整菌悬液的浓度为1.8×108CFU/mL，稀释成梯度为1.8×107CFU/mL、1.8×106CFU/mL、1.8×105CFU/mL、1.8×104CFU/mL、1.8×103CFU/mL，对试验组每尾鱼缓慢腹腔注射0.1 mL菌悬液，对照组鱼则注射0.1 mL生理盐水。对其进行常规管理，随时观察。分离菌株的致病性根据各组鱼的病死数和剖检病变程度来确定，依据寇氏法计算半致死剂量（LD50）。

1.6 药敏试验

采用K-B纸片扩散法，无菌条件下取100 μL纯化细菌培养18 h的菌液制成1.0×108CFU/mL菌悬液，用涂布棒均匀涂抹在琼脂培养基上，用无菌镊子将抗生素药敏纸片均匀地贴在距离培养皿边缘15 mm处的菌液培养皿表面，倒置在28℃培养24 h，测量抑菌圈直径大小，根据美国临床实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standard Institute，CLSI）的抗菌药物敏感性试验执行标准，判定药敏结果。

2 结果分析

2.1 病原菌的形态特征

从病鱼肝脏中分离得到一株优势菌株SD1010，该菌株菌落边缘整齐、灰白色、湿润、表面光滑，杆状，革兰氏染色阴性。

2.2 生理生化特性鉴定结果

表2 菌株SD1010的生理生化特性

2.3 16S rRNA基因序列分析结果

菌株SD1010的16S rRNA基因测序结果为1 431 bp，将得到的序列在NCBI上进行BLAST分析，结果显示，菌株SD1010测序序列与Gen Bank中迟缓爱德华氏菌基因序列的16S rRNA序列同源性为98.00%；构建的系统发育树表明，菌株SD1010与迟缓爱德华氏菌聚为一类。根据菌株SD1010的细菌特征、生化鉴定特性及其16S rRNA序列分析可知，菌株SD1010为迟缓爱德华氏菌（图1）。

图1 菌株SD1010的16S rRNA基因的系统发育树

2.4 人工感染试验结果

人工感染后，发病大口黑鲈的主要症状与自然感染菌株SD1010的大口黑鲈症状相似（图2），对照组无发病症状和死亡现象。根据寇氏法计算可得菌株SD1010对杂交鳢的半致死剂量为1.43×105CFU/g（表3）。

图2 大口黑鲈攻毒病症图

表3 人工感染结果

2.5 药敏实验结果

药敏结果显示（表4），菌株SD1010对多粘菌素B、万古霉素、多西环素、丁胺卡那、头孢哌酮、头孢呋辛、头孢拉定、氟苯尼考高度敏感，对红霉素、新霉素、氨苄西林、苯唑西林、利福平中度敏感，而对克林霉素、氯霉素、四环素、卡那霉素、庆大霉素、青霉素、磺胺异恶唑耐药。

表4 菌株SD1010的药敏试验结果

3 讨论

迟缓爱德华氏菌由日本科学家于1962年从患病鳗鲡体内进行病原分离时首次发现，该病原菌常见于水产动物，相继有罗非鱼、黄颡鱼、斑点叉尾鮰、南方鲇、鲫鱼、鲢鱼、鲮鱼、鳜鱼、大菱鲆、牙鲆、日本鳗鲡、鲟鱼等水产动物感染迟缓爱德华氏菌的报道，对水产养殖业危害极大，本研究从大口黑鲈病例中分离到迟缓爱德华氏菌在国内尚属首次。

迟缓爱德华氏菌感染鱼类的典型症状为肛门红肿、腹腔内有大量腹水，但肠道无腹水，肝肾肿大并伴有出血，头部发红，有的鱼类出现“裂头”[4]。本研究对象大口黑鲈则食欲下降，生殖孔发红，肝肾肿大出血，腹部膨大，在感染后期产生了“头穿孔”的现象，继而在发病一段时间后引起大规模死亡，与迟缓爱德华氏菌致病症状类似。因迟缓爱德华氏菌传播机制尚未明确，主要通过鱼类的消化道、鳃或受伤的表皮侵入鱼体，因此，保持良好的养殖条件可能是预防和控制该病害的更有效方法。

经典的细菌分类鉴定是基于分离菌株的形态特征和生理生化特征，耗时长，过程复杂，准确度不好。目前，鱼类细菌性疾病诊断常采用常规表型鉴定结合16S rRNA测序分析比对鉴定，病原菌鉴定更显准确性[5]。本次研究从大口黑鲈病鱼肝脏内分离获得一株纯化细菌，在培养基生成圆形、光滑、湿润、半透明的灰白色小菌落，革兰氏染色为阴性，生理生化鉴定与迟缓爱德华氏菌标准菌株结果一致，16S rRNA PCR测序比对并构建系统发育树分析显示，菌株SD1010与迟缓爱德华氏菌16S rRNA聚为一族，与Gen Bank已公布的迟缓爱德华氏菌参考菌株的16S rRNA序列相似性在98.00%，以上鉴定为迟缓爱德华氏菌，鉴定结果良好。

本研究分离菌株SD1010对多粘菌素B、万古霉素、多西环素、丁胺卡那、头孢哌酮、头孢呋辛、头孢拉定、氟苯尼考高度敏感，对红霉素、新霉素、氨苄西林、苯唑西林、利福平中度敏感，而对克林霉素、氯霉素、四环素、卡那霉素、庆大霉素、青霉素、磺胺异恶唑耐药。其中，红霉素、氯霉素、青霉素等抗生素已被列为水产养殖禁用药。临床上可选用多粘菌素B、万古霉素、多西环素、丁胺卡那、头孢哌酮、头孢呋辛、头孢拉定、氟苯尼考作为用药参考[6]。

4 结束语

大口黑鲈感染迟缓爱德华氏菌后引发死亡，临床上可选用多粘菌素B、万古霉素、多西环素、丁胺卡那、头孢哌酮、头孢呋辛、头孢拉定、氟苯尼考高度敏感药物进行治疗。