大视场线扫描共聚焦全息显微成像

纵浩天，张运海，王发民，缪 新

（1.中国科学技术大学生物医学工程学院，安徽合肥230026；2.中国科学院苏州生物医学工程技术研究所江苏省医学光学重点实验室，江苏苏州215163）

1 引 言

显微镜是人类观察与探索微观世界的重要工具，它在生物医学和工业检测等领域都发挥着重要的作用。然而，大部分细胞或生物组织的光学吸收系数很小，利用传统显微镜观察时需要对样本进行染色或荧光标记处理，但这种处理往往会带来光毒性和光污染，从而对细胞的活性产生不利的影响。针对这一问题，Zernike相衬（Phase Contrast，PC）显微镜和微分干涉（Differ⁃ential Interference Contrast，DIC）显微镜应运而生，为活细胞非标记成像研究提供了有效的手段［1-2］。它们基于光的衍射和干涉原理将样本的相位差信息转化为振幅信息，从而实现对无染色样本的观察。随着光学显微技术的发展，相位成像逐渐成为研究热点，定量相位成像技术得到了长足的发展［3-11］。

20世纪50年代，Marvin Minsky发明了共聚焦显微镜，由于它能够获得高分辨率、高对比度的图像和真正的光学切片，目前已经在工业检查、生物和医学领域得到广泛应用［12-14］。然而，传统的共焦显微镜采用基于强度的成像方式，这意味着丢失了样品的相位信息。为了恢复相位信息，有研究者在共焦显微镜中采用了差分干涉法和电光相位调制法［15］。近年来，数字全息技术（Digital Holography，DH）作为一种新兴的定量相位成像方式，在光学计量、生物学和医学中得到了广泛的研究和应用［16-18］。DH作为一种宽场成像方式，虽然可以实现数字重聚焦，但仍不能抑制离焦光来实现真正的光学切片。

共焦全息显微镜（Confocal Holographic Mi⁃croscopy，CHM）的概念 是由Herring在1997年［19-20］提出的，用于研究微重力下的流体。CHM在成像中需要一个非常复杂的光学系统，这使得它很难应用在其他领域。2012年，Goy等［21］将DH合并到点扫描共聚焦显微镜（Point-scanning Confocal Microscope，PCM）中，提出了一种数字点扫描共聚焦显微镜（Digital Point-scanning Confocal Microscope，DPCM），并于2013年［22］采集到生物样品的相位图。2014年，Schnell等［23］将合成光学全息术（Synthetic Optical Holography，SOH）与点扫描共聚焦成像系统结合，通过移动参考光束实现了同轴全息，完成了合成光学全息定量共焦相位成像。2016年，Liu初步验证了线扫描共聚焦与DH结合的可行性［24］，在实验中用分辨率板做测试，但并未使用生物样本，实际应用中还存在问题，比如受光路系统和CCD或CMOS等光电传感器件的阵列尺寸和像素总数的限制成像视场过小，环境振动会引起相位抖动横纹等，从而限制了这种成像技术在大视场测量中的应用与推广。

本文将线扫描共聚焦与离轴DH相结合，利用位移台扫描获取多条干涉线并合成二维共聚焦全息图，采用频域滤波法提取样本的振幅与相位分布，实现线扫描共聚焦全息成像。采用多区域拼接法，在不影响分辨率的情况下扩大了线扫描共聚焦全息成像的视场；且利用相邻剖面相似的特点校正了环境、机械振动等外部因素所造成的相位抖动横纹问题，为相关仪器的研制提供了依据与指导。

2 方 法

线扫描共焦全息成像以DH为基础，以高相干光源激光器作为光源（目前多为He-Ne激光器），迈克尔逊干涉仪或马赫-曾德尔（Mach-Zehnder，M-Z）干涉仪作为基本光路框架，将高相干的激光分为两路，分别为探测光和参考光，利用线探测光和线参考光发生干涉从而产生一维干涉条纹。干涉条纹包含了物体的振幅与相位信息。通过狭缝滤除非焦面杂散光，用CCD作为探测器记录干涉条纹进而得到全息图。

2.1 数字全息

在离轴数字全息的过程中，物光波与参考光波以一定的夹角在全息面上发生干涉并被CCD记录下来。物光波的复振幅含有振幅和相位信息，但是CCD只能记录强度信息，因此使用参考光与物光波发生干涉，使物光波的相位信息转化为强度信息，即全息图，于是相位信息便被记录在干涉条纹中。后续的重建过程即从全息图的条纹信息中将振幅与相位信息提取出来并处理。

图1 离轴全息记录示意图Fig.1 Schematic diagram of off-axis holographic record⁃ing

定义到达CCD记录面时物光波O(x，y)和参考光波R(x，y)的复振幅分别为：

式中：A1(x，y)和A2(x，y)分别是物光和参考光的振幅分布，φo(x，y)和φr(x，y)分别是物光和参考光的相位分布。CCD记录面上的光强可以表示为：

将式（1）和式（2）中两束光波的复振幅代入式（3）并化简可得：

式（4）为全息图的分布，前两项表征的是物光波和参考光波的振幅；而第三项则是物光与参考光的干涉项，在全息图中表现为干涉条纹的分布，包含物光的振幅和相位信息，并且分别受到参考光振幅和相位的调制。由于物光与参考光存在一定的夹角，引入了参考光的载频，因此干涉得到的全息图经傅里叶变换后，所得的空间频谱图的各干涉像相互分离，在全息图衍射场中有0级和±1级干涉项。在滤波重建的过程中，需要消去+1级项中参考光的载频，消去R*的方法可以表示为：

IR=(|R|2+|O|2)R+|R|2O+RRO*，（5）

式中，第一项为直透光或者零级像；第二项为+1级项或者原始像，包含物光的原始信息；第三项是产生畸变的共轭像，也称为-1级项。在频谱中将+1级项|R|2O单独滤出，由于参考光一般为平面波，所以其振幅常作为常数忽略。一般情况下需要通过数值衍射的方式重建物光场，但线扫描共焦全息显微成像利用的是像面全息，逆变换到空间域后无需进行衍射重建。强度与相位分布分别为：

2.2 线扫描共聚焦全息

2.2.1 光路结构

线扫描共焦全息显微镜是在线扫描共聚焦系统的基础上，增加一路参考光，形成迈克尔逊干涉仪框架，如图2所示。激光经扩束准直后，经柱面镜CL单方向会聚，即一个方向为平行光，另一个方向会聚，目的是为了在最终样本面形成一条焦线，后续需要利用这条焦线扫描成像。由分光棱镜BS分光后，反射的一路为常规线扫描共聚焦光路，经物镜在样本面会聚成一条焦线，由位移台控制样本移动实现扫描（见图4）。透射的参考光路中采用和探测光路中相同的结构，目的是为使两路的光程差维持在光源的相干长度内，并且使参考光在CCD靶面上会聚成一条焦线，与物光的焦线发生干涉，生成共聚焦干涉线并由CCD记录。为了实现一维离轴DH，在yoz平面内稍微倾斜分光棱镜BS来引入一个离轴角。

图2 线扫描共聚焦全息成像系统光路Fig.2 Optical path of line-scanning confocal holographic imaging system

2.2.2 处理过程

由线扫描共聚焦成像的结构可知，在探测端需要有狭缝滤除离焦光。本文采用的是虚拟狭缝，利用CCD的若干行像素宽度作为狭缝。优势为后期数据处理时可以根据具体情况自由调节狭缝的宽度。具体公式如下：

式（8）的含义是将虚拟狭缝内的若干行像素对应相加作为当前第n行的像素值。虚拟狭缝的宽度为：

式中：λ为光源波长，M为系统放大倍数，NA为物镜的数值孔径，P为CCD的像素尺寸。

线探测光与线参考光干涉生成一维干涉线并由CCD记录，随着位移台的移动扫描，CCD再记录下一个位置的一维干涉线，以此类推。相对于针对每一条线都进行全息重建，分别提取振幅与相位然后生成二维图［24］，本文采用式（8）和式（9）处理每条一维干涉线，然后合成二维全息图，后续只需进行一次全息重建便可分别获得振幅与相位图，处理过程更加简洁高效，处理流程如图3所示。

图3 图像处理流程Fig.3 Flow chart of image processing

2.2.3 抖动校正

在位移台扫描的过程中，由于干涉条纹很敏感，环境振动、机械振动可能会引起线上干涉条纹的整体抖动，导致不同线的条纹分布会出现错位。而相位信息正包含在条纹分布中，这种错位会引起相位的偏移。由于是线扫描，所以对于每一行的像素，其相位偏移值是相同的，利用相邻行剖面相似的特性，采用下述步骤可以很大程度上校正抖动：

（1）用第2行像素的相位减去第1行对应像素的相位，然后对得到的结果取平均，得到第2行相对于第1行的相位偏移量∆h1；

（2）第2行所有像素相位值都减去相位偏移量∆h1；

（3）用第n+1行像素的相位减去第n行对应像素的相位，然后对得到的结果取平均，得到第n+1行相对于第n行的相位偏移量∆hn；

（4）第n+1行减去相位偏移量∆hn；以此类推，直至最后一行。

这是一种较为近似的算法，能很大程度上去除抖动所产生的横纹，对于部分阶跃型样本可能存在较小的误差，但在绝大多数情况下可以达到良好的效果。

2.3 大视场扫描拼接方法

受到线扫描共焦成像系统与CCD靶面尺寸的限制，无法同时满足分辨率与视野的实际应用需求。为了解决这一问题，本文采用子图拼接的方式，在保证CCD采样分辨率的情况下获取更大的成像视场。采用位移台移动扫描的方法实现多幅子图的采集，对采集的子图拼接，达到大视场成像的目的，并且结构相对简单。

图4 子区域图像采集的扫描路径示意图Fig.4 Schematic diagram of scanning path for image ac⁃quisition in sub region

在线扫描共焦全息显微系统中，光源发出的光束通过系统后在样本面形成一条焦线，利用位移台控制样本移动实现焦线对样本的扫描，如图4所示。根据重叠区域要求和单次成像区域大小确定位移台沿X方向的位移量，位移台每移动一个位置，控制位移台沿Y方向移动扫描并采集一幅图像。相比于其他拼接方式［16］，本文为了充分利用线扫描成像的优势，使后续拼接过程更加高效与便捷，利用位移台沿Y方向连续扫描出一矩形区域，使用矩形区域拼接的方式，过程如下：

（1）控制位移台移动到某一待成像位置后，然后沿Y方向扫描一矩形区域，命名为A1，位移台复位；

（2）控制位移台沿X方向平移一固定步进，以步骤1中相同位移量控制位移台扫描一矩形区域，命名为A2，位移台复位；

以此类推，至最后一个子区域An，后续对A1～An做拼接处理。为了避免信息丢失，子区域之间需要有一定的重叠区域，重叠区域的大小可以根据沿X轴的视场，通过控制位移台的步进调节。

常规拼接算法通常采用基于特征点的图像配准方法去确定图像之间的重叠区域，然后再进行拼接处理。但本文中重叠区域的大小可根据位移台横向步进值和子区域横向视场的大小计算得到，所以直接进行拼接效率更高，拼接算法流程如图5所示。

图5 图像拼接流程示意图Fig.5 Flow chart of image splicing

根据图像重叠部分的大小，将具有含有重叠区域的子区域分为非重叠区域和重叠区域，例如A与B、C与D。其中B与C为重叠区域，两者叠加并平均可得重叠部分E图，随后将三部分A，E，D拼合，便可完成子区域拼接。多幅子区域图像之间的拼接与上述相同。重叠区域的大小是根据位移台横向步进值和子区域横向视场计算得到的，因此拼接精度取决于位移台的位移精度。

3 实验结果

线扫描共焦全息显微镜系统原理如图2所示。光源选用He-Ne激光器，波长为632.8 nm；显微物镜放大倍数为10；探测器采用面阵CMOS（滨松flash 4.0 V2），像素数为2 048×2 048，像素尺寸为6.5μm×6.5μm，靶面尺寸约为13 mm，具有自定义工作区域的功能，本实验采用的虚拟狭缝就是利用这一功能，工作在条状区域下的采集速度可达7 894 frame/s。柱面镜CL的焦距f=100 mm，透镜L4的焦距f=100 mm，筒镜为OLYMPUS X71显微镜内置，焦距为180 mm。L3的焦距f=300 mm，可以算得系统的总放大倍数为30。

局部狭缝内线干涉线如图6所示。根据实验系统的相关参数，由式（9）算得狭缝宽度约为8.9行像素，实验中取整数8行，将面阵CMOS工作区域设置为2 048×8像素。首先对分辨率板进行成像，由以上过程合成整幅线扫描二维共聚焦全息图，如图7所示。

图6 局部狭缝内的线干涉条纹Fig.6 Line interference fringes in local slit

以图7（a）中的子区域A1为例，利用离轴全息重建算法，首先利用傅里叶变换得到其频谱，可以看到-1级项、0级项、+1级项依次排布。根据全息重建原理，需要将+1级项单独滤出并频移到频谱中心，利用傅里叶逆变换到空间域便可得到物光波复振幅，可以分别根据式（6）、式（7）提取物光的振幅与相位，如图8所示。

图7 合成二维共聚焦全息图Fig.7 Synthesis of 2D confocal hologram

图8 数据处理过程Fig.8 Demonstration of principle for operation and data processing

实验中采用减去系统空采相位图的方法去除系统的相位畸变。用离轴全息重建算法分别对子区域A1，A2，A3进行处理，提取出振幅和相位信息。其中相位图中的横纹是由于在位移台扫描过程中，环境、机械振动引起的条纹抖动，导致最终重建出的线扫描共聚焦全息图中的条纹产生了横向上的微小错位，使最终重建的相位图中产生横纹，符合前期的预测。用第二节中的方法来校正抖动所带来的横纹，效果如图8（d）所示。图9为图8（c）中沿白线和8（d）中对应位置的剖面对比，校正前后对比效果明显，计算方差可知本次实验中抖动程度降低了约84.7%。

图9 抖动校正前后对比Fig.9 Comparison before and after jitter correction

图10 分辨率板成像拼接结果。（a）拼接后大视场振幅图；（b）拼接后大视场相位图；（c）局部放大；（d）（c）中沿虚线部分剖面；（e）与传统线扫描共聚焦的轴向半高展宽对比Fig.10 Splicing results of the image of resolution plate.（a）Large field of view amplitude map after splic⁃ing；（b）Large field of view phase map after splicing；（c）Local magnification of red rectangle area in（a）；（d）Profile along the dashed red line in（c）；（e）Comparison of axial FWHM with tra⁃ditional line scanning confocal microscope（LCM）

对子区域重建后的图像进行拼接处理，拼得大视场图像如图10所示。拼接所得的视场达1 160μm×1 043μm，本文采用线扫描共聚焦成像方式，所以根据图像线扫描方向可分为共聚焦方向和非共聚焦方向，理论上共聚焦方向和非共聚焦方向有着不同的成像分辨率，共聚焦方向的成像分辨率要略高于非共聚焦方向［25］。根据图10（d）可以看出，分辨率板第8组第6条可以分辨清楚，共聚焦方向分辨率高于2.19μm，非共聚焦方向可分辨第8组第4条，非共聚焦方向分辨率高于2.73μm。由此可见，线扫描共聚焦全息成像的分辨率符合传统线扫描共聚焦显微镜的分辨率的规律。通过在物镜焦面附近沿Z轴方向按相同步进值移动反射镜，测量其成像总强度，然后绘制可得其归一化强度曲线，如图10（e）所示。测两者的半峰全宽（Full Width Half Maxi⁃mum，FWHM）可知，线扫描共聚焦全息显微镜的轴向分辨率与传统线扫描共聚焦显微镜相当。

图11 为扫描洋葱表皮细胞表面的结果。常见的动植物细胞直径约为5～100μm，理论上本成像系统的分辨率足以对一般的生物细胞成像。这里以洋葱表皮细胞为例，图中细胞近似长方形，宽度约为60～100μm，长度约为150～300 μm。图11（a）为线扫描共焦扫描并拼接所得的洋葱细胞成像图；图11（b）为线扫描共焦全息重建并拼接所得的洋葱细胞成像图；图11（c）为全息重建算法提取出的相位信息，利用最小二乘解包裹算法［26］解包裹处理后拼接所得的相位成像图。

图11 洋葱细胞大视场成像拼接结果Fig.11 Image splicing results of onion cells with large field of view

4 结 论

本文采用线扫描共聚焦与离轴DH相结合的方法，将获得的共聚焦干涉线合成二维共聚焦全息图，采用频域滤波法成功提取出分辨率板和洋葱表皮细胞的相位信息，实现了基于共聚焦的定量相位成像。采用相邻剖面相似的特性校正了由于环境或机械振动所造成的相位横纹，使本实验中重建所得相位图的抖动程度降低了84.7%。并且提出了一种针对线扫描共聚焦全息成像的大视场成像系统，采用控制位移台移动样本扫描的方法达到对样本的大范围线扫描的目的，实现了对大视场子区域的采集与拼接，达到了大视场成像的目的。该系统通过控制位移台扫描3个矩形并且有一定重叠区域的子区域进行拼接，在不影响成像分辨率的前提下获得了1 160μm×1 043μm的大视场，并且采集更多子区域可以获得更大的视场。它具有结构简单、易于应用的优势，可为相关仪器的研制提供参考。