基于网络药理学的双黄连抗炎作用机制分析

炎症反应与机体息息相关，既是人体重要的自我防御机制，也是大多数急慢性疾病的来源。研究表明，炎症参与了临床大多数疾病的发展变化，包括肺炎、脓毒血症、酒精性肝炎、动脉粥样硬化、糖尿病和肿瘤等。双黄连由金银花、黄芩、连翘三味药材组成，广泛应用于临床。现代药理学研究表明，三味药材都具有抗菌抗病毒，解热抗炎，保肝抗氧化，免疫调节等作用；其中，据报道黄芩和连翘还具有抗肿瘤作用；黄芩具有抗缺血再灌注损伤的作用。尽管目前对于双黄连制剂抗炎作用机制的研究已有大量报道，但在有效成分、靶点以及通路上对其整体的药理作用机制尚未完全阐明。

中药所含成分复杂，多个靶点协同发挥作用，在治疗很多疾病方面有不可取代的作用。正因为多组分协同作用的特点，其发挥药效的物质基础和作用机制更为复杂，如何科学系统地研究其药理作用机制是中药现代化的难点之一。网络药理学基于多向药理学、系统生物学，利用网络建模的方法，从系统的角度出发，综合分析主要药效成分、潜在作用靶点和分子机制之间的相互联系，与中医整体观念相呼应。本研究于2018年8月至2019年11月根据网络药理学研究思路综合分析双黄连口服制剂的主要药效成分和可能的分子机制，以期为后续的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 构建双黄连口服制剂的化学成分数据库

根据中药系统药理学分析平台（traditional Chinese medicine system pharmacology platform，TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php），以“金银花”“黄芩”“连翘”为关键词检索这三味药材的全部化学成分，其中金银花含有236个，黄芩含有143个，连翘含有150个，金银花和黄芩含有的相同成分18个，金银花和连翘含有的相同成分21个，黄芩和连翘含有的相同成分11个，三味药材共有的化学成分有4个，故而“金银花-黄芩-连翘”中含有的所有相关化学成分共482个。

1.2 活性化合物的筛选

药物在体内需经过吸收、分布、代谢、排泄的过程，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）是指药物口服后到达体循环的相对量，高口服生物利用度是药物是否具有生物活性的一个重要指标；类药性代表化合物与已知药物的相似性，类药性≥0.18表示该成分与Drugbank数据库里药物具有一定的相似性；Caco-2细胞结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，Caco-2细胞渗透率决定人体吸收药物的生物利用度。本研究以口服生物利用度阈值OB≥30%，类药性≥0.18，Caco-2细胞渗透率≥0.4作为筛选条件，通过评价化合物的体内过程选择生物活性较高的化合物。

1.3 网络构建与分析

通过TCMSP数据库寻找42个活性成分的潜在作用靶点，并将靶点数据通过UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/），选择物种为人，进行归一化和标准化命名，最终得到三味药材活性成分的潜在靶点为141个。利用Cytoscape3.6.1软件将活性化合物与其潜在靶点蛋白生成（Compound-target，C-T）网络图。通过网络拓扑学分析，探究三味药材的药理作用机制及机理。

1.4 炎性疾病靶点的筛选

通过比较基因组学数据库（Comparative Toxicogenomics Database，CTD）（https：//ctdbase.org/），以“inflammation”为关键词检索与炎症相关的基因。

1.5 蛋白互作（protein

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protein interaction，PPI）网络的构建

在生化过程中，蛋白往往通过相互作用形成大分子复合物来完成其生物学过程。通过STRING数据库（https：//string-db.org/），获取上述双黄连和炎症相关的交集靶蛋白在系统水平的相互作用信息。将可信度设为≥0.7，得到PPI网络图，并对结果进行分析。

1.6 基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和KEGG通路富集分析

采用DAVID 6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对PPI网络中的蛋白进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，用FDR错误控制法（FDR＜0.05）对P值做检验校正，设定阈值P＜0.05，得到潜在靶点参与表达的生物学通路，探究双黄连的药理作用机制。

1.7 成分

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靶点

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信号通路网络构建

将交集蛋白与其相关联的药对中成分，构建成与炎症相关的双黄连化学成分-靶点网络图。交集蛋白与KEGG富集出的生物通路构建出炎症靶点-通路网络图。利用Cytoscape 3.6.1软件中的合并功能将以上两种网络合并，从而得出成分-靶点-信号通路网络图。

2 结果

2.1 化合物的筛选

符合筛选条件的化合物共有55个。其中，JYH7（豆甾醇，Stigmasterol）是金银花和黄芩共有成分，HQ2（汉黄芩素，wogonin）是黄芩和连翘共有成分，三者都含有JYH6（β-谷甾醇，betasitosterol）。有9个化学成分没有相应的作用靶点，所以共有42个化学成分符合筛选条件，其中金银花7个，黄芩24个，连翘11个，见表1。

2.2 化合物靶点筛选

通过TCMSP平台检索这42个活性化合物的潜在作用靶点，共得到141个靶点。将这些成分与靶点通过Cytoscape 3.6.1软件构建网络图，得到的网络图包括163个节点。节点的度（degree）表示网络中和节点相连的路线的条数，度值越大表明节点越重要。从表2中可以看出，度值较大（度值≥25）的化合物为HQ2，HQ4（黄芩素，baicalein），JYH6，JYH7；度值较大的边（度值≥25）前列腺素G/H合成酶2（Prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2），前列腺素G/H合成酶1（Prostaglandin G/Hsynthase 1，PTGS1）等。

表1 双黄连中含有的42个与炎症相关的化合物信息

2.3 双黄连与炎症交集靶点

分别利用TCMSP和CTD数据库查询出双黄连候选化合物141个靶点，炎症417个相关基因。其中双黄连与炎症的共有基因53个，即双黄连候选化合物作用靶点与炎症共有53个交集蛋白。

2.4 PPI网络的构建

利用STRING 11.0数据库，通过相关设置，得到53个交集蛋白的PPI网络图，见图1。图中共有53个节点，397条边，平均度值为15。其中节点代表交集蛋白，边则表示蛋白间的关联作用，线条的粗细表示关联度的大小。

2.5 GO功能富集分析

在DAVID 6.8数据库中对PPI网络中得到53个靶点进行GO功能富集分析，共得到519条GO条目。在这些生物过程里，根据FDR错误控制法（FDR≤0.05）确定了77个GO条目。其中，这些条目中包含58个生物过程的条目，11个分子功能的条目，8个细胞组成的条目，主要参与酶结合，血管生成，激素调节，细胞凋亡，转录调节，缺氧，衰老等。见图2。

2.6 KEGG通路富集分析

利用David 6.8数据库对PPI网络中53个靶蛋白基因进行KEGG通路富集分析，共有90条生物通路，其中错误发现率FDR≤0.05的有46条。其中包括Pathways in cancer，Hepatitis B，Colorectal cancer，Proteoglycans in cancer，TNF signaling pathway，Apoptosis，Small cell lung cancer，p53 signaling pathway等。根据P值排序，前30个生物通路见图3。

2.7 成分

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靶点

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信号通路网络构建

整理炎症相关的成分靶点关联信息及相关靶点通路关联信息，并将关联信息上传至Cytoscape 3.6.1软件中，并利用该软件的合并功能构建双黄连活性成分-作用靶点-信号通路网络图，见图4。图中包括成分36种，用三角形表示；炎症相关靶点53个，用椭圆形表示；信号通路30条，用长方形表示。筛选出的双黄连候选活性成分的作用靶点分布在不同的信号通路，相互协调，通过调控不同的信号通路发挥抗炎作用。

其中，根据度值前五位的化合物为HQ2，HQ4，JYH3（β-胡萝卜素，beta-carotene），HQ1（金合欢素，acacetin），HQ9（千层纸素A，oroxylin A），见表3；度值前五位的靶点为PTGS2，PTGS1，诱导型一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，inducible，NOS2），转录因子p65（Transcription factor p65，RELA），外消旋-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1），见表4。

3 讨论

本研究通过网络药理学研究方法，筛选出双黄连抗炎的36个活性成分、53个交集靶点和30条信号通路。通过分析成分-靶点-信号通路网络图发现度值前五位的化学成分为黄芩素、汉黄芩素，β-胡萝卜素，金合欢素，千层纸素A，可能是双黄连抗炎的物质基础。黄芩素快速抑制肿瘤坏死因子α（TNFα）的释放，导致白细胞介素-6（IL-6）和一氧化氮的减少发挥抗炎作用。黄芩素通过PI3K/Akt信号通路，保护糖尿病心肌病大鼠免受氧化应激和心肌组织炎症的损害。汉黄芩素通过抑制一氧化氮，细胞因子，趋化因子和生长因子在巨噬细胞中发挥抗炎作用。汉黄芩素通过抑制Akt磷酸化，减少中性粒细胞浸润，促炎细胞因子的产生，黏附分子表达来治疗急性肺损伤。β-胡萝卜素能够抑制活性氧（ROS）介导的炎症信号，并减少炎症介质在感染组织中的表达，包括白细胞介素-8（IL-8），NOS2和环氧化酶-2（COX-2）。金合欢素通过干扰PI3K/Akt/IKK和MAPK的活化，从而下调巨噬细胞中炎性NOS2和COX-2基因的表达来预防炎症相关肿瘤发生。金合欢素通过抑制炎症细胞因子Toll样受体4（TLR4），IL-6和TNF-α的释放，从而减少缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡，表明其可作为治疗急性冠状动脉综合征患者的新药。千层纸素A通过抑制COX-2蛋白的表达，一氧化氮、前列腺素E2的产生来抑制炎症反应。以上报道证实了双黄连中黄芩素、汉黄芩素，β-胡萝卜素，金合欢素，千层纸素A五种成分的抗炎活性，我们的研究结果与其一致。度值前五位的靶点为PTGS2、PTGS1、NOS2、RELA、AKT1。PTGS前列素内环氧化物合成酶，分为结构型PTGS1和诱导型PTGS2，PTGS1参与机体正常的生理功能；PTGS2作为炎症诱导的氧化应激关键酶，在多种体内外因素诱导下生成的主要产物前列腺素，是重要的炎症介质，参与炎症发生的重要环节。NOS2在细胞受到细胞因子或免疫微生物刺激时，催化产生大量一氧化氮，过多的一氧化氮通常会引起炎症、疼痛、免疫紊乱等症状。RELA基因在调控炎症的NF-κB信号通路中起着极其重要的作用，但尚未有研究报道双黄连通过对RELA基因的调控来发挥药理作用，因此此结果待进一步确认。AKT1基因调节细胞增殖和生长，参与包括细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的细胞过程，AKT1的异常表达与癌症有关。除RELA基因外，已有研究显示其他几个基因与双黄连发挥抗炎作用息息相关。

表2 双黄连化合物-炎症靶点网络中的关键节点及拓扑学性质

表3 双黄连抗炎成分-靶点-信号网络中化学成分的节点及拓扑学性质（前12）

表4 双黄连抗炎成分-靶点-信号网络中靶点的节点及拓扑学性质（前12）

通过对53个交集靶点的GO功能和KEGG通路富集分析发现，GO功能富集主要表现在对酶和激素的调节、血管生成，细胞凋亡，转录调节等生物过程和分子功能上。KEGG通路富集分析中，很多基因富集到癌症信号通路上如Pathways in cancer，Proteoglycans in cancer，Colorectal cancer，Small cell lung cancer。已有研究表明双黄连中黄芩素通过降低基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达和上调P53途径相关蛋白来抑制结直肠癌细胞的增殖。汉黄芩素能够上调凋亡蛋白的表达，抑制PI3K/AKT和STAT3信号转导途径通过自噬和凋亡细胞死亡抑制结直肠癌细胞的生长。千层纸素A能使细胞周期停滞在G2/M期来抑制结肠癌的发展。目前，未曾有双黄连治疗小细胞肺癌的报道，此结果有待进一步临床验证。在Hepatitis B信号通路中，Guo等研究发现双黄连中黄芩素可显著抑制乙型肝炎病毒DNA聚合酶，在体内和体外均具有抗乙型肝炎病毒的活性。本研究可能为其治疗乙型肝炎进一步的分子机制研究提供了基础。本研究显示，还有一些基因富集到了Apoptosis信号通路，p53 signaling pathway，TNF signaling pathway中。李彦林等研究发现双黄连通过引起细胞凋亡的途径来抑制大鼠白血病细胞增殖。双黄连中汉黄芩素和黄芩素降低抗凋亡因子B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）的表达，通过p53依赖性方式通过人结肠癌细胞的Akt激活诱导凋亡。汉黄芩素具有抑制肿瘤细胞生长，诱导细胞凋亡和抑制血管生成的能力，其分子机制涉及活性氧，Ca，NF-κB，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体和肿瘤坏死因子。在激素相关的信号通路Thyroid hormone signaling pathway和Estrogen signaling pathway中，有结果表明双黄连中黄芩素通过诱导凋亡和自噬来抑制未分化的甲状腺癌细胞的生长。但未见双黄连通过调节甲状腺激素发挥作用的报道，因此此结果仍需进一步验证。双黄连中汉黄芩素通过抑制雌激素受体和刺激内皮细胞中一氧化氮和NOS2的表达而发挥抗炎作用。此项结果显示双黄连通过抑制雌激素受体来发挥抗炎作用。

综上所述，由于中药发挥药效通过多成分、多靶点、多途径的特点，本研究通过网络药理学思路，对双黄连的复杂网状关系进行分析。预测了双黄连的主要药效成分、潜在作用靶点和机制，对双黄连进一步的分子机制研究具有参考价值。然而，由于化合物筛选没有考虑到量的影响和配伍变化，获取信息的数据库不全面性和滞后性，本研究存在一定的局限性。

图1 双黄连与炎症的交集靶蛋白蛋白互作（PPI）网络

图2 蛋白互作（PPI）网络中靶标的基因本体（GO）富集条形图

图3 蛋白互作（PPI）网络中相关靶点KEGG富集气泡图（前30）

图4 双黄连抗炎成分-靶点-信号通路