LC3相关吞噬作用（LAP）在疾病中的研究进展①

李义芳 段晓妍 李小婷 欧 亮 耿 昊 陈 莹 （中国医科大学尘肺研究室，沈阳110122）

吞噬作用在多细胞生物中的主要作用有两方面，一是作为免疫系统防御病原体入侵，二是降解凋亡细胞或细胞碎片防止自身免疫性疾病发生［1］。鉴于吞噬体和自噬体膜来源不同，LC3 相关吞噬作用（LC3-associated phagocytosis，LAP）与自噬的分子机制存在差异。细胞内大分子蛋白及受损细胞器主要通过自噬形成的双层膜自噬体降解，细胞外来物质（凋亡细胞、入侵病原体）主要通过LAP 形成的单层膜吞噬体降解［2-3］。LAP 与多种疾病发生密切相关，如自身免疫性疾病、肿瘤、病原微生物感染及艾滋病等。本文综述LAP相关疾病的研究进展。

1 LAP概述

2007 年首次发现一种新形式的吞噬作用，这种吞噬作用将自噬机制引入吞噬体成熟和降解过程。小鼠巨噬细胞（RAW-GFP-LC3）吞噬酵母多糖、脂多糖包裹的乳胶颗粒或直接吞噬酿酒酵母、大肠埃希氏菌过程中，LC3向单膜吞噬体募集，伴随细胞表面模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）激活、相关分子元件募集、细胞骨架重排并弯曲质膜形成吞噬体、吞噬体与溶酶体融合并酸化降解内容物，该过程被称为 LAP［2］。LAP 不依赖于经典自噬起始复合物（包括 ULK1/2、FIP2000 和Atg13）参与［4］。LAP 激活由病原微生物或凋亡细胞受体依赖性识别触发，除吞噬细胞的FcγR（已知可诱导常规吞噬作用）外，Toll 样受体（TLRs）、磷脂酰丝氨酸受体（TIM4）或β-葡聚糖受体（Decin-1）信号传导也可触发LAP［5-7］。受体识别后发生吞噬作用，内化的吞噬物存在于单膜吞噬体内，该吞噬体被称为LAP 吞噬体（LAPosome），其被磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）快速修饰，PI3P 由 VPS15、VPS34、Beclin-1、UVRAG 和Rubicon 组成的磷脂酰肌醇3-激酶复合物（PI3KC3）产生，PI3KC3复合物是第一个参与LAP调节的多蛋白复合物，其中Rubicon 和PI3P 对LAP 至关重要。Rubicon 是一种含有RUN 结构域的蛋白，既往报道称Rubicon 是自噬负调节因子，现已证明LAP 依赖于 Rubicon 过程，是 LAP 发生必需物质［2，4-5，8-9］。因此，Rubicon 缺乏为LAP 机制和作用研究提供契机，也可作为去除自噬混杂因素的契合点。Rubicon 在LAP 中有 2 个重要功能。首先，Rubicon 在 LAPo⁃some 中对定位和稳定 PI3KC3 复合物是必需的［9］。其次，Rubicon 对NADPH 氧化酶复合物组装和功能发挥是必需的，NOX2 是吞噬细胞的主要氧化酶。LAPosome 被 PI3P 修 饰 后 ，胞 质 NOX2 亚 单 位p40phox、p47phox、p67phox 和 Rac1 与膜 NOX2 亚单位 p22phox 和 gp91phox 在 LAPosome 膜上组装为NADPH 氧化酶复合物（NOX2），具有活性的NOX2可产生活性氧（ROS）。NOX2 和 ROS 对后续 LAP 过程中 LC3 脂质化非常重要［4，10］。LC3 脂质化需 2 种泛素（UB）样接合系统，包括ATG5-ATG12 结合系统和LC3-吞噬体表面上的磷脂酰乙醇胺（PE）结合系统。第一个UB 样结合系统为ATG7（类E1 样酶）激活ATG12，可与ATG10（E2酶）相连接。将ATG12与ATG5 结合，进一步与ATG16L1 结合形成多聚体ATG15-ATG12-ATG16L1 复合物。第二个UB 样结合系统为胞质LC3 被ATG4 切割产生LC3Ⅰ，其与ATG7 和ATG3（E2 样酶）连接，连接 ATG15-ATG12-ATG16L1 复合物的 ATG3-LC3Ⅰ与 LAPosome 表面上的PE 共价连接使LC3I 转化为脂质化LC3Ⅱ。LC3 脂质化是LAPosome 成熟的标志，也是LAPo⁃some 和溶酶体融合的必要条件。与溶酶体融合后，吞噬物被腔内酸性水解酶降解，溶酶体膜中的跨膜泵有助于降解物再循环和再利用［11］。

LAP 被认为是机体天然免疫应答的组成部分，在病原微生物清除和抗炎过程中发挥重要作用。研究证明，成熟的LAPosome 吞噬死亡细胞后与溶酶体融合的过程可促进TGF-β和IL-10释放，同时抑制促炎因子 IL-1β、IL-12p40、IL-6 和 IP-10 分泌，治疗炎症和自身免疫性疾病［12］。

2 LAP与疾病的关系

2.1 LAP 在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythe⁃matosus，SLE）中的作用 SLE 是典型的慢性多系统、多脏器损伤的自身免疫性疾病，以大量自身抗体及补体形成为特征［13］。SLE 病因多样，包括环境因素和遗传易感性因素。清除凋亡或坏死细胞功能缺陷也是导致SLE 的重要机制，有效吞噬和清除死亡细胞可阻止自身免疫综合征产生［14］。正常情况下，体内凋亡细胞可被巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞等专职和非专职吞噬细胞及时有效地吞噬清除，防止细胞内自身抗原等内容物释放和机体自身免疫应答激活［15］。SLE发病的主要原因为患者血液循环和淋巴结中的死亡细胞及对自身抗原产生自身抗体的血清水平不断积累却无法有效清除［16］。因此吞噬细胞对凋亡细胞的吞噬清除对维持机体内环境稳态具有重要意义。

将凋亡细胞重复注射至LAP 缺陷但自噬完整的动物体内，如Rubicon-/-、NOX2-/-、Cre+ATG5f/f等基因敲除小鼠，凋亡细胞被吞噬但未被降解，血清自身抗体水平促炎因子水平显著升高，加速小鼠SLE样疾病。相反，自噬缺陷但LAP 完整小鼠可顺利清除凋亡细胞，未出现SLE样疾病，且与野生组动物一样，可响应凋亡细胞产生IL-10。此外，8 周内反复注射凋亡细胞的Rubcn-/-小鼠比对照组小鼠更早出现SLE样症状，包括循环自身抗体产生和肾脏损伤。进一步检测LAP 缺陷时细胞因子产生情况，采用骨髓来源巨噬细胞吞噬胸腺凋亡细胞，发现LAP 缺陷巨噬细胞（Cre+Atg5f/f，Cre+Rubcnf/f，Cre+NOX2f/f等）无法产生IL-10，但分泌高水平的IL-1β、IL-6和CXCL-10。与野生型小鼠相比，LAP 缺陷（Cre+Atg5f/f，Cre+Atg7f/f或Rubcn-/-）小鼠血清中促炎因子（IL-1β、IL-6）水平升高，而LAP 完整（WT 型和Cre+FIp200f/f）小鼠血清IL-10水平升高，所有LAP缺陷型小鼠细胞因子水平在衰老时均发生改变，IL-10 水平降低，促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-12p40、IL-10、CXCL1、MIP-1β 和MCP-1）水平升高，而LAP完整型小鼠则未出现上述情况。因此，动物中LAP 缺陷，而非自噬缺陷（Cre+FIp200f/f）可能导致SLE［4］。全基因组关联（GWAS）研究已确定ATG蛋白遗传缺陷将导致自身免疫性疾病，SLE 患者中发现ATG5 多态性，表明ATG5 可能在人类自身免疫性疾病预防中发挥作用［17］。

LAP中，凋亡细胞清除通过吞噬细胞表面TIM-4受体与死亡细胞质膜上的磷脂酰丝氨酸（PtdSer，PS）受体结合完成。研究发现，TIM-4 缺陷小鼠T、B 细胞过度活化，凋亡细胞清除障碍，产生大量自身抗体，加重肾脏免疫复合物沉积，进而促进SLE疾病进展［4］。

2.2 LAP 在肿瘤免疫耐受中的作用 研究证明自噬蛋白在抑制肿瘤或促进肿瘤发展中起重要作用［18］。自噬蛋白在LAP 中参与多种机体免疫应答，说明LAP可能影响肿瘤生长或治疗。LAP是机体有效清除死亡细胞的必需过程，可抑制炎症因子释放［5］。肿瘤微环境中，吞噬凋亡肿瘤细胞的LAP 过程可抑制IFN-β 等炎症因子分泌，抑制机体T 细胞免疫应答和抗肿瘤免疫促进肿瘤生长。LAP缺陷小鼠（Cre+Becn1f/f，Cre+Atg5f/f，Rubcn-/-，TIM4-/-）皮下移植皮肤黑色素瘤细胞（B16F10），肿瘤生长受抑制，LAP功能完整（Cre+Fip200f/f或Atg14f/f）小鼠中未观察到对肿瘤的抑制作用。同样在皮下植入刘易斯肺癌（lewis lung carcinoma，LLC）细胞和结肠癌MC38细胞也观察到LAP 缺陷小鼠肿瘤细胞生长受抑制，说明LAP功能缺陷可抑制肿瘤生长［19］。

肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macro⁃phages，TAMs）是肿瘤中存在的巨噬细胞，其主要分为经典活化的巨噬细胞（M1 型）和替代性活化的巨噬细胞（M2 型），M1 型巨噬细胞具有抗肿瘤作用；M2 型巨噬细胞却有促肿瘤作用［20］。LAP 缺陷的髓细胞中，M1型巨噬细胞表面标记物CD86表达增加，而M2 型巨噬细胞表面标记物CD206 表达下降，说明LAP 功能缺陷可调节TAMs 极化。髓细胞中的LAP 缺陷可抑制免疫抑制性细胞，如粒细胞型髓源抑制细胞（PMN-MDSC）和单核细胞型髓源抑制细胞（Mo-MDSC）浸润，促进机体免疫应答，发挥抗肿瘤作用［19］。

干扰素基因刺激蛋白（stimulator of interferon gene，STING）是双链DNA（double-stranded DNA，ds⁃DNA）诱导机体产生天然免疫应答的重要信号转导蛋白，STING 通路在识别肿瘤来源DNA 中起重要作用［21］。肿瘤微环境中，吞噬凋亡肿瘤细胞的LAP 过程中，吞噬体中的内容物被溶酶体降解，无法激活STING通路，抑制IFNs分泌。LAP缺陷下，被吞噬的凋亡肿瘤细胞无法降解，释放细胞内容物（如DNA、酶类等）激活STING通路，诱导IFNs分泌。Rubcn缺陷小鼠中，LLC肿瘤生长受抑制，但这种效应在敲除STING 后丧失。STING 缺陷不会抑制肿瘤生长，在STING 缺陷小鼠中同时敲除Rubcn 也不影响肿瘤生长，TAMs 中也未观察到CD206 表达下调。因此，LAP 缺陷抑制肿瘤生长的作用依赖于STING。研究表明，IFNs 对肿瘤生长具有抑制作用。LAP 缺陷可抑制肿瘤生长，当LAP 和IFN-α/β 受体同时存在缺陷时，抗肿瘤保护效应完全丧失。LAP 缺陷下，TAMs 向炎症基因表达分化，触发STING 依赖的IFN-Ⅰ应答，促进 T 细胞活化，分泌 IFN-γ、GZMB 等效应子发挥抗肿瘤作用。LAP 缺陷可起抗肿瘤作用，该作用依赖于STING的IFN应答［19］。

肿瘤细胞的侵袭性、高增殖率和高有丝分裂指数在肿瘤微环境中发生持续性细胞死亡，也可由抗癌治疗过程（如放射治疗和药物治疗）引发肿瘤细胞死亡。因此，在肿瘤各阶段，肿瘤微环境中都含有大量凋亡或死亡细胞，而这些细胞可激活专职吞噬细胞的LAP 功能。巨噬细胞吞噬和清除凋亡细胞的过程启动LAP，细胞分泌IL-10 和TGF-β，后者可抑制抗原提呈细胞（树突状细胞）成熟，可使肿瘤细胞逃避免疫系统杀伤，促进肿瘤生长和转移［20］。研究表明，敲除巨噬细胞LAP 特异蛋白可抑制吞噬凋亡细胞降解，抑制肿瘤细胞增殖和转移，提示抑制LAP 可作为肿瘤治疗的潜在靶点［21］。肿瘤转移是肿瘤细胞与肿瘤微环境相互作用的结果，LAP 对肿瘤转移的机制需进一步研究。

2.3 LAP 在病原微生物清除中的作用 吞噬作用对病原微生物降解和清除至关重要，是细胞抗菌免疫的关键机制之一［22］。LAP 可通过其特有的LAPo⁃some 结构提高病原体杀灭效率。众多病原体，如细菌、真菌及原生动物等都可通过激活吞噬细胞表面PRRs触发LAP，最终杀灭病原微生物。

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocyto⁃genes，L.m.）是目前唯一通过LAP 过程被靶向杀灭和清除的病原菌。巨噬细胞表面受体Mac-1（αMβ2、CR3）在LAP 清除L. m. 的过程中扮演重要角色。Mac-1缺乏的巨噬细胞无法激活鞘磷脂酶AsMease。L. m. 与 Mac-1 相互作用激活 ASMase，ASMase 将膜鞘磷脂裂解为神经酰胺，由此产生的神经酰胺富集膜平台促进NOX2 亚基组装，从而激活NOX2。NOX2 产生的ROS 不仅在正反馈循环中放大AS⁃Mase活性，还可募集LC3至含L.m. 的吞噬体。LAP通过促进含有L.m. 的吞噬体与溶酶体融合，L.m.被溶酶体中酸性水解酶降解，增强巨噬细胞抗菌活性及小鼠抗菌免疫应答。此外，NOX2 缺陷巨噬细胞中ASMase 活性受损，表明LAP 靶向杀灭L.m. 过程中需要Mac-1 诱导ASMase，以及ASMase 和NOX2的相互作用［23-24］。

念珠菌属，新型隐球菌和烟曲霉是人类常见条件致病菌，当宿主免疫功能低下或受损时，可引发严重疾病［25］。LAP在真菌感染期间的抗真菌免疫中起关键作用，可有效杀灭真菌。Dectin-1 可识别真菌细胞壁的β-1，3-葡聚糖，在启动LAP 过程中起关键作用［7］。KYRMIZI 等［26］发现，烟曲霉分生孢子萌发后，暴露出β-1，3-葡聚糖，通过Dectin-1/Src/Syk激酶信号级联反应触发LAP，随后LC3-Ⅱ被募集至含曲霉菌的吞噬体，最终杀灭烟曲霉。Dectin-1 缺陷小鼠的β-葡聚糖识别功能受损，导致对烟曲霉引发的真菌感染易感性增强［27］。此外，研究发现，慢性肉芽肿病患者NOX2基因编码突变导致LAP 功能受损，更易受烟曲霉感染导致侵袭性曲霉病，严重危及患者生命［28］。证明启动 LAP 受体 Dectin-1 在抗真菌宿主防御中的重要性。尽管LAP 在病原微生物降解和清除发挥重要作用，但一部分病原微生物对抗LAP 过程中已进化出多种逃避策略。根据病原体种类不同，每种微生物逃避机制也不尽相同。细菌对LAP 的逃避主要依赖于Ⅲ型分泌系统（Type 3 secretion system，T3SS）和毒力因子作用，真核真菌和寄生虫则通过细胞壁或细胞膜成分逃避LAP杀伤。

福氏志贺菌进入细胞后可被LAP 靶向降解，但部分志贺菌一方面可在其T3SS 及其效应蛋白作用下脱离LAPosome，另一方面T3SS 分泌的IcsB 可募集宿主蛋白Toca-1 至胞内细菌周围，这两种蛋白相互作用可抑制细胞中早期吞噬体LC3募集［29］。类鼻疽假单胞菌也利用其T3SS 及效应蛋白BipD 和转运蛋白 BopA 逃避 LAP 的杀伤作用。BipD 或 BopA 缺陷菌株可使更多类鼻疽假单胞菌定位于成熟的LAPosome，使其在巨噬细胞中存活率降低［30］。杜氏军团菌通过其特有的T4SS 效应蛋白RavZ 逃避LAP，使其无法脂质化LC3，吞噬体无法与溶酶体融合为内质网样液泡，导致杜氏军团菌在巨噬细胞中存活率提高［31］。结核分枝杆菌（Mtb）可激活多种PRR，但LAP 无法有效清除Mtb。Mtb 可分泌CpsA蛋白［一种含有LytR-CpsA-Psr（LCP）结构域的蛋白］，阻止NOX2 在吞噬体上组装进而抑制ROS 产生，影响LC3 募集，从而抑制LAP。研究证明，含有ΔcpsA 突变体的吞噬体募集NOX2，产生ROS，并成熟为吞噬溶酶体，ΔcpsA 突变体在LAP 缺陷巨噬细胞中存活率提高，因此Mtb是否逃避LAP取决于Cp⁃sA［32］。真菌细胞壁成分黑色素可抑制LAP 的杀伤作用，黑色素可选择性地从吞噬体膜中去除p22phox，从而抑制LAP。黑色素敲除株（Δalb1）可促进NOX2 活化和ROS 生成。向暴露于Δalb1 的人单核细胞中加入纯化黑色素可完全抑制ROS 生成，阻断 LAP［29，33］。米根霉（一种引发毛霉菌病的丝状真菌）也利用黑色素延长其在巨噬细胞的存活时间，米根霉中的黑色素可阻止吞噬体成熟进而阻止LAP对其的靶向杀伤作用［34］。虽然巨噬细胞对利什曼原虫前鞭毛体进行内化可促进LC3 脂质化，但利什曼原虫可通过表面金属蛋白酶GP63 抑制LAP。GP63 直接切割SNARE 家族的蛋白囊泡相关膜蛋白8（VAMP8）可抑制NOX2 向含有利什曼原虫的吞噬体募集，从而导致LAP 功能障碍。因此，活体利什曼原虫可主动抑制LAP的靶向作用［35］。

2.4 LAP 在获得性免疫缺陷综合征（acquired im⁃munodeficiency syndrome，AIDS）中的作用 AIDS 由人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染所导致，HIV 根据其基因型分类可分为HIV-1 和 HIV-2，HIV-1 是引起 AIDS 全球流行的主要亚型，我国也以 HIV-1 流行为主［36］。HIV-1 病毒蛋白u（Vpu）是HIV-1 特有的Ⅰ型膜蛋白，主要具有2 个功能：在内质网中通过泛素-蛋白酶系统引导CD4 受体快速降解；抵抗骨髓基质细胞抗原2（bone marrow stromal cell antigen，2BST-2）作用，使 HIV-1子代病毒颗粒可顺利从被感染细胞中释放［37］。

BST-2 是一种在HIV-1 感染细胞中由干扰素α诱导产生的宿主限制因子。病毒复制晚期，BST-2通过其N 末端胞质尾段和GPI 与细胞膜连接，再将其末端插入病毒包膜和质膜中将新生HIV-1病毒颗粒牢固束缚于被感染细胞表面，阻止病毒释放。MADJO 等［38］首次证明 Vpu 利用 LAP 机制降解细胞膜上的BST-2 以促进HIV-1 病毒传播。LAP 相关蛋白 Beclin1、ATG5 与 LC3C 促进 Vpu 拮抗 BST-2 的作用，促进HIV-1 释放。Vpu 与BST2 跨膜结构域作用过程中，Vpu 选择性将LC3C 募集于质膜。ATG5 定位于LC3C 募集位点，使LC3C 脂质化并紧密附着于质膜。Vpu 诱导的LC3C 局部富集可加速BST2 分子降解，导致出芽点的BST2 被清除。Vpu 诱导的LAP可能有助于将含有BST2 和病毒的吞噬体与溶酶体融合，并促进其降解。因此，Vpu 被认为是LAP 受体，将LC3C分子募集于携带BST2分子的吞噬体上，并在出芽部位加速BST2 分子被LAP 降解，以促进HIV-1病毒传播［38-39］。

3 展望

综上所述，LAP 与人类疾病联系密切。SLE 疾病模型中，LAP可抑制促炎因子产生，并通过凋亡细胞有效吞噬和清除阻止疾病发展，发挥机体保护作用。肿瘤疾病模型中，LAP 缺陷可激活STING 通路进而释放IFNs，起抗肿瘤作用。针对机体感染病原体种类不同，LAP 清除病原体的机制各有不同。且LAP 可调节视网膜色素上皮细胞回收类视黄醇，有助于视力维持［40］。因此，LAP的功能具有双面性，取决于其被激活的环境。目前关于LAP 与疾病关系的研究尚处于起步阶段，随着相关研究深入，有望发现更多LAP在疾病方面的分子调控机制。