Xpert MTB/RIF在结核分枝杆菌及利福平耐药性检测中的应用分析

刘静，王晓林，田旭升，陈敏

（宁夏第四人民医院，宁夏 银川 750021）

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的一种慢性传染病，是我国乙类法定报告传染病，因感染率高、发病率高，病程长且缺乏有效的疫苗严重影响人类的健康。近年来结核病发病和死亡人数均排法定甲乙类传染病前列，且结核病是目前由单一致病菌导致死亡最多的疾病[1]，是我国重点控制的重大疾病之一。实验室检查为诊断结核病提供重要依据，但是结核分枝杆菌抗酸染色阳性率低，特异性差，而结核分枝杆菌培养虽为结核分枝杆菌检查的金标准，但耗时较长，难以满足临床实际需求[2-3]。利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术（以下简称Xpert MTB/RIF）为半巢式荧光定量PCR方法，针对结核分枝杆菌特有的序列rpoB基因上81bp利福平耐药决定区进行检测，可得到是否存在结核分枝杆菌及该菌对利福平是否耐药的结果。Xpert MTB/RIF检测时间短，可在2.5 h内获得结果，能够满足临床对快速诊断方法的迫切需求，对减少结核病传播具有重要意义。本研究通过比较涂片染色、固体培养、固体药敏和Xpert MTB/RIF检测，分析Xpert MTB/RIF在结核分枝杆菌及利福平耐药性检测中的效能，为临床选择实验室检测分析方法提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年5月至2019年5月我区疑似肺结核患者1271例，患者年龄13～93岁，其中男748例，女523例。对标本同时进行抗酸染色涂片镜检、罗氏固体培养，比例法药敏试验和Xpert MTB/RIF检测。

1.2 仪器与试剂 Gene Xpert检测仪器、Cartridge试剂盒及SR（sample reagent）均购自美国Cepheid公司，结核分枝杆菌抗酸染色涂片所需金胺O染液为珠海BASO公司生产，LED显微镜为德国ZEISS品牌，固体培养及比例法药敏试验所用培养基为河南赛诺特公司生产。

1.3 方法

1.3.1 标本收集 按照《结核病实验室检验规程》[4]收集合格痰标本3～5 ml，对标本同时进行抗酸染色涂片镜检、罗氏固体培养，比例法药敏试验和Xpert MTB/RIF检测，比较几种检测方法的检测效能。

1.3.2 抗酸染色涂片法 采用结核分枝杆菌金胺O荧光染色法染色，LED显微镜镜检。操作过程按照《结核病实验室检验规程》[4]进行。

1.3.3 固体培养 痰培养采用改良罗氏固体培养法，按照《结核病实验室检验规程》[4]进行标准操作。对培养出的菌株涂片染色进行确认。

1.3.4 药敏试验 采用比例法固体药敏试验，按照《结核病实验室检验规程》[4]进行标准操作。

1.3.5 Xpert MTB/RIF 严格按照说明书步骤操作，前处理管中以1:2加入痰标本和SR，吸取痰标本时选取脓性及黏稠部分，漩涡震荡10 s，室温静置15 min，待痰液充分液化后吸取2 ml至Cartridge试剂盒，上机检测。所有初治患者经Xpert MTB/RIF检测为利福平耐药均做二次复检确认。

1.4 统计学处理 SPSS 20.0统计分析软件处理数据。计数资料n用%表示，χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。Kappa检验，Kappa≥0.75为两种方法诊断结果一致性较好，0.4≤Kappa＜0.75,为两种方法诊断结果一致性一般，Kappa＜0.4，为两种方法诊断结果一致性较差。

2 结果

2.1 Xpert MTB/RIF检测与抗酸杆菌涂片染色法检测效能比较 样本总计1271份，Xpert MTB/RIF检测阳性582份，阳性率45.78%(582/1271)；抗酸杆菌涂片染色法检测阳性442份，阳性率为34.77%(442/1271)。以抗酸杆菌涂片染色法为金标准，Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的灵敏度为94.34%(417/442)，特异度为80.10%(664/829)。将Xpert MTB/RIF与抗酸杆菌涂片染色法的结果进行χ2检验和Kappa检验，差异有统计学意义P＜0.05，Kappa=0.693，表明Xpert MTB/RIF与抗酸杆菌涂片染色法的一致性一般。见表1。

表1 Xpert MTB/RIF检测与抗酸杆菌涂片染色法检测结果比较（n=1271）

2.2 Xpert MTB/RIF检测与固体培养法检测效能比较1271份样本中经改良罗氏固体培养法培养阳性492份，阳性率38.71%(492/1271)。以改良罗氏固体培养法为金标准，Xpert MTB/RIF检测灵敏度为94.31%(464/492)，特异度为84.85%(661/779)。将Xpert MTB/RIF与固体培养法结果进行χ2检验和Kappa检验，差异有统计学意义P＜0.05，Kappa=0.766，表明Xpert MTB/RIF与固体培养法的一致性较好。见表2。

表2 Xpert MTB/RIF检测与固体培养法检测结果比较（n=1271）

2.3 Xpert MTB/RIF检测利福平耐药与比例法药敏检测效能比较464份培养阳性标本完成耐药检测标本385例。采用比例法药敏试验检测到耐药菌株共77例，其中有58例利福平耐药，利福平耐药检出率15.06%(58/385)。Xpert MTB/RIF检测利福平耐药57例，利福平耐药检出率14.80%(57/385)。以传统药敏结果为金标准，Xpert MTB/RIF检测利福平耐药的灵敏度为98.28%(57/58),特异度为100%（327/327)。

两种方法检测结果进行Kappa检验，Kappa=0.990，两者具有较高一致性。见表3。

表3 Xpert MTB/RIF与比例法药敏试验检测利福平耐药性结果（n=385）

3 讨论

本研究中Xpert MTB/RIF、固体培养及抗酸染色涂片对结核分枝杆菌的检测效能显示，三种方法的阳性检出率：Xpert MTB/RIF(45.78%)＞固体培养(38.71%)＞抗酸染色涂片(34.77%),与文献报道相符[5-8]。研究显示[9]，抗酸染色涂片法镜检阳性至少需要5×103CFU(菌落形成单位)/ml，而Xpert MTB/RIF的最低检测限可达到131 CFU/ml，这大大提高了结核分枝杆菌的检出率。并且对于涂片阴性的标本，仍有约20.00%（165/829）经过Xpert MTB/RIF检测出阳性，Xpert MTB/RIF在涂阴肺结核的诊断方面显示出明显优势。对于培养，有118例培养阴性的标本经Xpert MTB/RIF检测出阳性，提示培养法可能受到不同性状的标本消化液的加入量，液化程度等因素的影响导致检测结果的偏差。这都显示了Xpert MTB/RIF较高的检测效能。

本研究结果显示Xpert MTB/RIF检测与固体培养及抗酸染色涂片具有较好的一致性，这与武晓英[10]、李静[11]的研究结果一致。以改良罗氏固体培养法为金标准，Xpert MTB/RIF检测敏感度为94.31%（464/492），特异度为84.85%（661/779），与现有国内外研究结果相似[12-13],说明Xpert MTB/RIF对结核分枝杆菌检出率及准确率高。

对利福平耐药性的检测结果显示，比例法药敏试验与Xpert MTB/RIF对利福平耐药检出率极其相近（15.06%，14.80%），检测结果高度一致（Kappa=0.990）。且以传统药敏结果为金标准，Xpert MTB/RIF检测利福平耐药的灵敏度高达100%，特异度98.28%，与文献结果相近[14]，说明Xpert MTB/RIF可以很好的检测利福平的耐药性。本研究传统药敏试验利福平耐药检出率15.06%，Xpert MTB/RIF方法利福平耐药检出率14.80%，与翁绳凤等[15]研究结果一致，提示利福平耐药情况不容乐观，也从反方面体现出了Xpert MTB/RIF对利福平检测的重要意义。从时间上讲，相对于固体培养和传统药敏，Xpert MTB/RIF将利福平耐药的肺结核患者的发现提前了4～8周，显示了该技术在快速检测结核分枝杆菌及利福平耐药的诊断价值。

在利福平药敏试验结果中，有1例Xpert MTB/RIF与比例法药敏试验不符，比例法药敏试验检测利福平耐药，Xpert MTB/RIF检测利福平敏感，Xpert MTB/RIF二次复核结果仍然为敏感。近年来的研究发现几乎所有的利福平敏感菌株在81bp核心区都具有相同的核酸序列，利福平耐药菌株中95%以上由rpoB基因突变导致。而此例不符合项推测原因很可能其突变区域不是rpoB基因，属于95%rpoB基因突变之外的5%区域的突变。遗憾的是实验室不具备继续进行基因测序的实验条件，有待今后更多的研究讨论。

本研究过程中严格把控痰标本质量，发现涂片阳性率较本实验室之前的年涂片阳性率有约5%的提升，提示在日常工作中，需要进一步加强标本质量控制。研究中发现，对于涂阳病人，Xpert MTB/RIF对利福平耐药筛查非常有意义，可快速得到利福平是否耐药的结果。文献报道，约90%利福平耐药的结核患者同时会异烟肼耐药[2]，对利福平单耐药的患者，无论异烟肼是否耐药，都会采取与耐多药患者相同的治疗方案。因此，检测出利福平耐药是多重耐药结核的一个很好和可靠的替代指标。这在临床诊疗中将大大缩短诊断时间，对患者早发现、早诊断、早治疗提供帮助。而对于初治患者，实验室对于Xpert MTB/RIF利福平耐药的检测结果应当特别谨慎，需要进行二次复检确认，防止误诊误治。

综上所述，Xpert MTB/RIF用于结核分支杆菌及其对利福平耐药的检测中具有较高灵敏度，特异性，准确性高，检测时间短，其快速高效的诊断对结核病患者尤其是耐多药患者筛查具有重要意义，能够为临床制定有效的诊疗措施提供可靠依据。