丹参酮Ⅱa通过AMPK/mTOR通路调节自噬促进急性白血病细胞凋亡作用机制研究*

潘一鸣 李蕊白 黄子明 王 婧 马 薇 陈信义 侯 丽

（北京中医药大学东直门医院，北京 100700）

急性髓系白血病（AML）是起源于造血干祖细胞的恶性克隆性疾病，占成人急性白血病的80%，临床表现为发热、出血、贫血和白血病细胞浸润，起病较急，自然病程仅3个月左右［1］。虽然化疗、支持治疗和造血干细胞移植（HSCT）的进步改善了AML的预后，但60岁以下成人AML的5年生存率仍只有30%～40%，高龄患者更低［2］。寻找新的治疗方法和药物意义重大。丹参是治疗AML的常用中药，其主要有效成分丹参酮Ⅱa具有良好的抗肿瘤活性，但丹参酮Ⅱa在AML中的作用和机制研究尚不充分，本研究通过AML细胞HL-60探究丹参酮Ⅱa体外抗白血病的效应和作用机制。

1 材料与方法

1.1 试药与仪器 丹参酮Ⅱa（货号HY-N0135，批号28232）、巴弗洛霉素A1（货号HY-100558，批号81280）由MedChemExpress公司生产。IMDM培养基（货号12440061）、青链霉素（货号15140122）、胎牛血清（货号10099141）由Gibco公司生产。CCK-8细胞增殖-毒性试剂盒（Cell Counting Kit-8，货号CK04）由日本同仁公司生产。吉姆萨染液（货号G1015）为Solarbio公司生产。一抗Caspase-3（货号ab32351）、PARP-1（货号ab191217）、LC3B（货号 ab192890）、p-AMPK（货号ab194920）、p-mTOR（货号 ab109268）、β-actin（货号ab8226）抗体由Abcam公司生产。辣根过氧化物酶标记的二抗（货号A0208、A0216）由碧云天公司生产。细胞培养箱（型号FormaTMSeries 3 Water Jacketed CO2Incubator）为Thermo公司产品。细胞光学显微镜（型号DM750）为莱卡公司产品。酶标仪（型号SpectraMax M5）为BioTek Instrments公司产品。蛋白电泳仪（型号Mini-PROTEAN Tetra）为伯乐公司产品。

1.2 细胞 急性髓系白血病细胞HL-60由中国科学院上海细胞库所提供，以含20%胎牛血清、1%青链霉素的IMDM培养基置于37℃、5%CO2的环境中培养，2～3 d换液。

1.3 CCK-8法检测细胞活力及增殖抑制率 取对数生长期细胞，设 0（对照组）、1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L丹参酮Ⅱa组，按1×104个/孔接种于96孔板后加药处理24 h和48 h，并另设仅含培养基的空白组。处理完毕后加入CCK-8各10 μL培养箱培养1 h后，用酶标仪测450 nm处吸光度值（OD），计算增殖抑制率和细胞存活率。将增殖抑制率数据用Graphpad Prism 7.00行非线性回归拟合获得IC50。结合24 h组IC50结果，设丹参酮Ⅱa 0 μmol/L+巴弗洛霉素A1 0 nmol/L组，巴弗洛霉素A1 20 nmol/L组，丹参酮Ⅱa 32 μmol/L组，丹参酮Ⅱa 32μmol/L+巴弗洛霉素A1 20 nmol/L组，予相应处理24 h后CCK-8法测细胞存活率。

1.4 吉姆萨染色观察细胞形态 丹参酮Ⅱa处理HL-60细胞24 h后，制成细胞涂片，甲醇固定，吉姆萨染片15 min后自来水冲洗，晾干，光学显微镜下观察。

1.5 Western blotting检测凋亡与自噬相关因子水平细胞经处理后以1×磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，冰上裂解细胞，提取总蛋白，制样，行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭3 h，裁膜，一抗4℃过夜，二抗孵育1 h，曝光。

1.6 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件。所有实验独立重复3次，计量资料以（±s）表示。经正态检验后，正态数据间比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HL-60增殖抑制率比较 随着丹参酮Ⅱ浓度升高，抑制HL-60作用增强，48 h效果强于24 h，见表1。行非线性回归拟合，得24、48 h丹参酮Ⅱ的IC50分别为 32.87、18.4 μmol/L，见表 1。分别取 0、16、32、64 μmol/L行后续实验。

表1 丹参酮Ⅱa对HL-60增殖抑制率影响（%，±s）

表1 丹参酮Ⅱa对HL-60增殖抑制率影响（%，±s）

丹参酮Ⅱa（μmol/L）24 h 48 h 1 2 4 8 16 32 64 128 4.38±2.14 6.47±1.81 8.29±3.54 16.30±3.78 32.57±8.07 48.87±3.77 68.20±3.05 80.37±2.16 9.14±1.69 13.63±4.25 19.84±2.20 29.45±3.04 41.02±4.72 62.68±2.64 79.13±1.92 93.42±1.17

2.2 不同浓度丹参酮Ⅱa对HL-60细胞形态的影响光镜下观察HL-60细胞，丹参酮Ⅱa 0μmol/L组细胞形态完整，细胞核大小均一；16 μmol/L组细胞核缩小，形态不均一，可见核固缩深染、含凋亡小体的凋亡细胞；32 μmol/L组凋亡细胞显著增加；64μmol/L组镜下见大量凋亡细胞和破碎细胞。见图1。

图1 不同浓度丹参酮Ⅱa对HL-60细胞形态影响（吉姆萨染色，400倍）

2.3 不同浓度丹参酮Ⅱa对HL-60凋亡因子水平的影响 随着丹参酮Ⅱa浓度的升高，Caspase-3减少，Cleaved-Caspase-3增多，PARP-1切割增多，见图2。行定量分析得各组与对照组间差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。表明丹参酮Ⅱa以浓度依赖的方式诱导HL-60细胞凋亡。

图2 不同浓度丹参酮Ⅱa对HL-60凋亡因子水平的影响

表2 不同浓度丹参酮Ⅱa对HL-60凋亡因子影响的相对灰度值定量分析（±s）

表2 不同浓度丹参酮Ⅱa对HL-60凋亡因子影响的相对灰度值定量分析（±s）

注：与0 μmol/L比较，*P＜0.05。下同。

凋亡因子Caspase-3 Cleaved-Caspase-3 Cleaved-PARP-1 n 3 3 3 0 μmol/L 1.03±0.08 0.23±0.02 0.35±0.05 16 μmol/L 0.83±0.05*0.29±0.02*0.59±0.06*32 μmol/L 0.64±0.01*0.38±0.02*0.76±0.03*64 μmol/L 0.53±0.06*0.78±0.03*0.92±0.05*

2.4 不同浓度丹参酮Ⅱa对HL-60自噬因子水平的影响 随着丹参酮Ⅱa浓度上升，p-AMPK、LC3B水平上升，p-mTOR水平下降，表明AMPK/mTOR通路和自噬被激活，见图3。定量分析得各组较对照组差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。表明丹参酮Ⅱa以浓度依赖的方式激活AMPK/mTOR通路，诱导HL-60自噬。

表3 不同浓度丹参酮Ⅱa对HL-60自噬因子影响的相对灰度值定量分析（±s）

表3 不同浓度丹参酮Ⅱa对HL-60自噬因子影响的相对灰度值定量分析（±s）

凋亡因子p-AMPK p-mTOR LC3B n 3 3 3 0 μmol/L 0.13±0.02 1.03±0.06 0.12±0.02 16 μmol/L 0.52±0.02*0.49±0.02*0.41±0.03*32 μmol/L 0.78±0.03*0.40±0.02*0.65±0.03*64 μmol/L 1.10±0.01*0.23±0.04*1.08±0.07*

图3 不同浓度丹参酮Ⅱa对HL-60自噬因子表达量的影响

2.5 不同浓度丹参酮Ⅱa和巴弗洛霉素A1对HL-60细胞存活率的影响 丹参酮Ⅱa 32 μmol/L组存活率降至（51.21±2.36）%，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；与巴弗洛霉素A1联用后存活率恢复至（76.82±3.05）%，与丹参酮Ⅱa 32μmol/L组对比差异具有统计学意义（P＜0.05），见表4。丹参酮Ⅱa诱导HL-60凋亡的作用被巴弗洛霉素A1部分抑制，表明自噬发挥了促凋亡作用。

表4 不同浓度丹参酮Ⅱa和巴弗洛霉素A1对HL-60细胞存活率的影响（±s）

表4 不同浓度丹参酮Ⅱa和巴弗洛霉素A1对HL-60细胞存活率的影响（±s）

注：与丹参酮Ⅱa 0 μmol/L+巴弗洛霉素A1 0 μmol/L组比较，△P＜0.05。

24 h细胞存活率（%）100.00±0.91 98.44±3.53 51.21±2.36△76.82±3.05△丹参酮Ⅱa（μmol/L）0 03 2 32巴弗洛霉素A1（nmol/L）0 20 0 20

3 讨 论

目前AML治疗主要依赖化疗和HSCT，虽然化疗使超过80%的年轻患者完全缓解，但5年总生存率不到40%［3］。此外化疗会导致骨髓抑制，引起出血和感染［4］。而HSCT要考虑禁忌证、费用、配型、移植物抗宿主病等问题［5-7］。以砒霜为代表的中医药在AML治疗中有许多成功的应用，继续深化相关研究意义重大［8］。痰瘀互阻是急性白血病的主要病因病机，治以“化痰散结、活血祛瘀”之法可以延长患者生存期，提高临床疗效［9-12］。丹参味苦性微寒，能补血活血祛瘀，凉血清心消痈，有“一味丹参，功同四物”之说。现代药理研究显示，其所含的丹参酮Ⅱa可抑制肺癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤生长［13］。本研究中，丹参酮Ⅱa可以抑制HL-60增殖，增加Caspase-3和PARP-1切割，进而诱导凋亡，效果呈时间和浓度依赖性。此外丹参酮Ⅱa会激活AMPK/mTOR通路引发自噬，联用自噬抑制剂巴弗洛霉素A1会弱化丹参酮Ⅱa的抗白血病作用，表明激活自噬强化了其抗白血病作用。

自噬异常与肿瘤发生、发展有关［14-15］。应激压力下肿瘤细胞通过自噬来保持内环境稳定［16］，但过度自噬引发自噬性死亡，常与凋亡相伴发［17］。对于AML，自噬相关蛋白较正常成熟粒细胞呈低表达［18］。小鼠敲除ATG7、ATG8后发生白血病［19］。AMPK/mTOR通路是调控能量代谢的重要通路，该通路激活会促进分解代谢（自噬）增加能量供给［20］。肿瘤细胞活性氧水平更接近氧化损伤的阈值，AMPK/mTOR激活后引发自噬进行分解代谢，产能增加，活性氧累积，氧化应激活化Caspase系统，最终Caspase-3转为Cleaved-Cas⁃pase-3，切割PARP-1等生物大分子，使肿瘤细胞死亡［21-22］。

综上所述，丹参酮Ⅱa通过诱导HL-60凋亡和自噬发挥抗白血病作用，AMPK/mTOR可能是介导这一效应的重要信号通路，值得进一步深入研究。