miR-100基因敲除小鼠模型的构建及基因型鉴定

乔思源，江文刚，汪思应

miR-100是定位于人类染色体11q24.1上大小约为22个核苷酸的微小RNA。微小RNA是一类非编码的单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，其通过与靶基因的3′UTR结合而转录后抑制基因表达，以诱导基因或者蛋白质降解。目前对miRNA的研究表明，miRNA几乎在每个细胞过程的调控中都起着至关重要的作用，包括增殖、凋亡、分化和血管生成等。miR-100在多种恶性肿瘤中发挥重要的调控作用，成为了近年来的研究热点。miR-100基因敲除模型的建立可以更好地研究miR-100在各种肿瘤等疾病中发挥作用的机制，从整体水平研究其功能。

miR-100小鼠是在C57BL/6小鼠的miR-100基因两端分别插入一个loxP的位点，所以外观上和C57 BL/6小鼠基本没有差异。而EIIa-Cre小鼠是表达Cre重组酶的工具鼠，可以特异性识别loxP位点从而将loxP位点间的基因敲除。该研究根据以上原理，通过将EIIa-Cre小鼠与miR-100小鼠进行配繁，得到miR-100敲除杂合子小鼠后再进行配繁，从而得到miR-100敲除纯合子小鼠。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级miR-100小鼠雌雄各3只和SPF级EIIa-Cre小鼠雌雄各3只，体质量均在20 g左右，购自南京大学模型动物研究中心， 所有小鼠饲养在安徽医科大学实验动物中心的SPF环境中。经安徽医科大学实验动物中心审批，并严格遵循实验动物使用的原则。

1.2 主要试剂与仪器

琼脂糖粉末(广州赛国生物科技有限公司)；TAE(50X)电泳缓冲液(上海碧云天科技有限公司)；PCR试剂盒(广州赛国生物科技有限公司)；DNA引物(中国赛默飞世尔科技有限公司)；qPCR试剂盒(上海吉玛制药技术有限公司)；PCR扩增仪(普通)(德国耶拿分析仪器股份公司)；化学发光凝胶成像仪(北京汇佳科技有限公司)；荧光定量PCR仪(上海伯乐生命医学产品有限公司)。

1.3 小鼠的饲养与繁殖

小鼠在安徽医科大学基础医学院实验动物中心饲养和繁殖。温度控制在25 ℃左右，湿度保持70%左右，明暗循环12 h/d，自由饮食和饮水。小鼠笼盒、垫料、饲料、饮用水均经过高温高压消毒灭菌处理。饲养过程中,每2 d进入动物房观察和记录小鼠的生长情况。每周更换1次小鼠垫料,每天补充饲料和饮用水。

1.4 小鼠尾部组织基因组DNA的提取

待子鼠1周龄时,将小鼠尾部组织剪取长约0.5 cm的小段于1.5 ml EP管中,在EP管中加入100 μl Buffer MP，4 μl Foregene Protease Plus，轻微涡旋混匀。65 ℃孵育25 min，然后95 ℃处理5 min，12 000 r/min离心5 min。转移上清液至新的EP管中，4 ℃或-20 ℃放置备用或直接用于PCR扩增。

1.5 PCR扩增反应及琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定

小鼠基因型鉴定引物序列：EIIa-Cre Cre-up:5′-GCCTGCATTACCGGTCGATGC-3′；EIIa-Cre Cre-low:5′-CAGGGTGTTATAAGCAATCCC-3′；miR-100 loxpF1:5′-TCTGGGCTCTCAGCAAGTAAATGTC-3′；miR-100 loxpR1:5′-ACTGAAGGGGATAAGGTTGCC-TCTC-3′；miR-100 loxpF2:5′-GGATGCCTTTTAGAG-TGGTAGACAC-3′；miR-100 loxpR2:5′-CTGTCAGCCAAGTCTTCACTTTCTG-3′；miR-100 loxpF1:5′-TCTGGGCTCTCAGCAAGTAAATGTC-3′；miR-100 loxpR2:5′-CTGTCAGCCAAGTCTTCACTTTCTG-3′。PCR反应体系：2x PCR mix 10 μl，前引物0.5 μl，后引物0.5 μl，超纯水5 μl，DNA模板4 μl，总体积20 μl。PCR 反应程序：EIIa-Cre程序为① 95 ℃、5 min；② 95 ℃、30 s；③ 63 ℃、35 s；④ 72 ℃、45 s；⑤ 72 ℃、3 min；⑥ 16 ℃ hold。②到④为循环反应，循环数为35。miR-100程序：① 95 ℃、5 min；② 95 ℃、30 s；③ 62 ℃、30 s；④ 72 ℃、30 s；⑤ 72 ℃、5 min；⑥ 4 ℃ hold。②到④为循环反应，循环数为35。miR-100程序：① 95 ℃、5 min；② 95 ℃、30 s；③ 62 ℃、60 s；④ 72 ℃、30 s；⑤ 72 ℃、5 min；⑥ 4 ℃ hold。②到④为循环反应，循环数为35。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖1.5 g，5X TAE 2 ml，双蒸水98 ml，溴化乙啶(EB)5 μl，DNA样本10 μl，电泳电压90 V，时间40 min，凝胶成像仪成像。

1.6 基因型结果判定

EIIa-Cre的引物扩增条带在481 bp左右，为EIIa-Cre小鼠。miR-100-loxpF1和miR-100-loxpR1的引物扩增条带flox在423 bp，wildtype在358 bp。miR-100-loxpF2和miR-100-loxpR2的引物扩增条带flox在379 bp，wildtype在312 bp。miR-100-loxpF1和miR-100-loxpR2的引物扩增条带flox在1 585 bp，wildtype在1 453 bp，而null在467 bp。

1.7 qPCR检测miR-100的表达

剪取F2代小鼠的鼠耳提取RNA，进行逆转录，得到的cDNA再进行定量PCR。用吉玛公司的microRNA&U6 snRNA Hairpin-itNormalization Quantitation RT-PCR试剂盒检测miR-100的表达。

1.7.1

逆转录体系 5×MMLV RT Buffer 4 μl，dNTP 0.75 μl，miRNA&U6 snRNA RT primer mix 1.2 μl，RNasin 0.25 μl，MMLV Reverse Transcriptase 0.2 μl，RNA样本根据各样本浓度及质量2 μg计算其所需体积，最后加入DEPC水补足体积到20 μl。采用PCR仪进行扩增，反应条件为：25 ℃、30 min；42 ℃、30 min；85 ℃、5 min；4 ℃保存。

1.7.2

qPCR体系 2×Real-time PCR Master Mix(SYBR) 10 μl，miRNA/U6 snRNA specific Primerset 0.4 μmol/L，ROX reference dye 2 μl，Taq DNA polymerase 0.2 μl，cDNA样本加入2 μl，最后DEPC水补足20 μl。定量PCR仪进行扩增，反应条件为：95 ℃、3 min；95 ℃、12 s；62 ℃、40 s，40个循环；4 ℃保存。

2 结果

2.1 小鼠的配繁

母代的miR-100小鼠与EIIa-Cre小鼠相互配繁成功得到F1代杂合子幼鼠，将获得的F1代小鼠雌雄相互交配得到F2代小鼠，其中就有miR-100全身敲除的纯合子，成功配繁出miR-100基因型小鼠。每只母鼠妊娠期为 19～21 d，每胎产3～8只幼鼠。

2.2 小鼠基因型鉴定结果

① 当5′端条带在423 bp和3′端条带在379 bp,null条带在1 585 bp时，为miR-100纯合子小鼠。② 只有当5′端和3′端不表达条带，同时null条带在467 bp时为miR-100纯合子小鼠。③ 当不满足以上两种条带时都为敲除杂合子小鼠。F1代部分小鼠基因型鉴定结果见图1，其中1号和2号条带满足①，所以为miR-100纯合子。而3、4、5、6、7号小鼠的条带①、②都不满足，所以为miR-100杂合子小鼠。将F1代miR-100杂合子小鼠雌雄合笼配繁，产生F2代小鼠进行基因型鉴定，结果如图2，其中只有1、2、3、8号小鼠的条带符合②，所以为miR-100纯合子小鼠。

图1 F1代小鼠的基因型鉴定结果1、2：均为小鼠miR-100纯合子小鼠；3、4、5、6、7：均为小鼠miR-100敲除杂合子小鼠

图2 F2代小鼠的基因型鉴定结果1、2、3、8：均为所需的miR-100敲除纯合子小鼠；4、5、6、7：均为miR-100杂合子小鼠

2.3 敲除小鼠其miR-100表达情况

为了进一步确认PCR结果的可靠性，选取经PCR鉴定获得的miR-100纯合子、miR-100杂合子、miR-100纯合子小鼠，用定量PCR的方法检测其miR-100的表达情况，结果如图3所示，相较于miR-100纯合子表达(0.987 138±0.012 340)，miR-100杂合子的miR-100表达(0.746 125±0.011 959)降低，而miR-100纯合子小鼠其miR-100的表达(0.000 157±0.000 009)几乎为零，差异有统计学意义(

F

=10 560.296，

P

<0.001)。结果与PCR方法鉴定所得的结果一致，验证了miR-100的敲除效果，证实了miR-100全身敲除小鼠模型。

图3 F2代小鼠的miR-100表达情况1、2：miR-100敲除纯合子小鼠；4：miR-100敲除杂合子小鼠；6：miR-100flox/flox纯合子小鼠；与1组比较：***P<0.001

3 讨论

作为研究最多的非编码RNA,miRNA是短的(约22个核苷酸)内源性非编码RNA，通过与靶标的3′-UTR结合促进mRNA降解并抑制转译在转录后水平调节基因表达。研究表明，超过50%的miRNA位于染色体上的所谓的脆性区域中，这些染色体经常被删除，扩增或重排与癌症相关。有研究表明，miRNA表达的异常表达模式和功能异常已被确定与包括癌症在内的多种人类疾病相关。研究表明，miR-100是miR-99家族的一员，其起源可以追溯到两侧对称动物的祖先。miR-100在肿瘤进展中的表达模式和作用尚未完全阐明，近期的研究显示了有争议的结果。在人类癌症中，miR-100被报道既可以作为致癌miRNA，也可以作为抑癌miRNA，这取决于肿瘤类型和微环境。已经有报道称miR-100的失调参与了肿瘤的发生、发展和耐药。miR-100的下调在多种人类肿瘤中被报道,如非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌(GC)、肝细胞癌(HCC)。该课题组前期建立的miR-100肝特异性敲除小鼠模型，在成年小鼠中，miR-100基因敲除对肝功能和形态没有影响。 在老年小鼠中，HE染色显示miR-100敲除可引起炎症细胞浸润和肝细胞核扩展，而且miR-100基因敲除的老年小鼠血清AST和ALT水平升高，表明其肝功能受损。

Cre/loxP系统是一种广泛应用于小鼠位点特异性基因操作的技术。该系统允许删除特定细胞、组织和整个生物体中感兴趣的基因，从而产生多种条件敲除小鼠品系。Cre/loxP系统是一种位点特异性的遗传调节技术，广泛应用于小鼠特定DNA位点的基因缺失、插入、逆转录和易位。该系统包含两个主要成分: Cre重组酶和loxP位点。 Cre重组酶可以特异性识别具有方向性的34碱基对不对称DNA序列的loxP位点。根据两个loxP位点的定位，Cre重组酶可以切除或逆转插入两个loxP位点之间的转基因序列。基于此，本课题组选择了miR-100小鼠，此类小鼠的miR-100基因两端分别被插入了一个loxP位点，然后将其和表达Cre重组酶的EIIa-Cre小鼠交配，从而能够获得miR-100被敲除的杂合子且表达Cre的小鼠，再将其进行交配就可获得miR-100被敲除的纯合子小鼠，成功建立miR-100 基因敲除小鼠模型，并按照SPF级标准进行饲养繁育。采用较为简便易行、重复性、适用性较好的琼脂糖凝胶电泳的方法进行基因型鉴定。虽然在饲养过程中，还没有发现miR-100的敲除和未敲除的小鼠有明显差别，但是为后续对miR-100基因的相关机制深入探究提供了较好的模型。