六种抑菌剂在香蕉开放式组培中的应用

罗燕羽 黄绍力 刘绍钦 刘伟光 魏利国 秦鹏

(广州市农业科学研究院 广东广州 510308)

香蕉（Musaspp.）为芭蕉科芭蕉属植物，是我国华南地区四大佳果之一，也是世界著名的热带、亚热带水果。在一些发展中国家与地区，香蕉还作为当地农民的主要粮食，被联合国粮农组织认定为仅次于水稻、小麦、玉米之后的第四大重要粮食作物［1］。由于传统的香蕉组织培养需要一个无菌的环境，要求接种过程、培养过程在无菌的环境中进行，使得人工、设施设备、培养基和供电成本等大大增加，而且香蕉属于一种低值的农产品，其投入成本高，大大限制了组织培养技术在香蕉产业中的推广应用［2］。尤其是近几年，随着物价、电力、人力成本的不断上涨，生产成本已越来越高，严重制约了香蕉组培苗产业规模扩大和质量提升，对香蕉优质种苗的培育也造成了严重的影响。因此，进行香蕉开放式组培的研究具有重要的意义。

开放式组织培养是指在抑菌剂的作用下，使植物组织培养操作脱离严格无菌环境，在自然、开放的有菌环境中进行植物的组织培养［3］，由于其既不需要高温高压灭菌，又不要求无菌操作，从而可以降低香蕉组织培养的生产成本和对高温高压灭菌锅等特种设备的要求，投入成本可以大幅度降低，是近年来发展逐渐成熟的一种低成本的开放式组织培养技术［4］，目前已成功应用于魔芋、甘蔗、红豆杉和构树等［5-15］植物中。

植物开放式组培的关键在于培养基中添加的抑菌剂［16-17］。。目前市场上应用于植物开放式组培的抑菌剂种类很多，不过不同的植物在组培过程中所产生的污染菌类不同，其适合的抑菌剂种类和浓度存在差异［18］。虽然关于香蕉开放式组培的研究已有报道［2］，但仅限于对含氯消毒剂的研究，并未对其他种类的抑菌剂进行筛选研究。本研究以巴西蕉为试验材料，通过在组培增殖和生根阶段的培养基中加入不同种类和浓度的抑菌剂，研究其抑菌效果和对香蕉组培苗增殖与生根生长的影响，以期筛选出适合于香蕉开放式组培的最佳抑菌剂种类和浓度，为今后香蕉开放式组织培养的进一步研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

供试香蕉为巴西蕉，采自广州市农业科学研究院花都基地。供试的6种抑菌剂均为市售品，分别为次氯酸钠（天津市致远化学试剂有限公司）、植培灵（上海宇涵生物科技有限公司）、益培隆（上海宇涵生物科技有限公司）、清菌易（深圳市中科前锦有限公司）、S106 杀菌剂（江西万年创新植物组培应用技术研究所）、80%代森锰锌可湿性粉剂（四川国光农化股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 外植体处理

将嫩芽清除表面泥土后于阴凉通风处晾干，环剥叶鞘并切去部分假茎，留取5 cm×5 cm×8 cm的茎尖。超净台中用75%酒精浸泡10 min，无菌水冲洗5 次后进行切割，留取2 cm×2 cm×3 cm 的茎尖，再用0.1%的升汞溶液消毒8 min，期间不断振荡，用无菌水清洗5～6 次后切割，留取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的茎尖，接入不定芽诱导培养基：MS+5.00 mg/L 6-BA +0.02 mg/L NAA +5.00 mg/L 肌醇+30 g/L 蔗糖+6 g/L 卡拉胶，于28℃的培养室中培养，光照强度为2 000 lx，光照时间为10 h/d。

将诱导出的不定芽，经病毒检测后不带病毒的不定芽继代3 次，继代培养基为：MS+3.00 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6 g/L 琼脂，光照强度为2 000 lx，光照时间为10 h/d，温度控制在28℃左右，每代培养25 d。

1.2.2 培养基的配置

香蕉开放式组培的增殖与生根培养基采用传统香蕉组培的培养基配方，将定容煮沸后的培养基调节pH为5.8～6.0之后，添加入（V/V）0.01%、0.02%、0.03%、0.04% 的 次 氯 酸 钠，0.10%、0.25%、0.35%、0.45%的植培灵，0.03%、0.05%、0.10%、0.20% 的 益 培 隆，0.03、0.06、0.12、0.18 g/L的清菌易，0.01%、0.03%、0.05%、0.07%的S106 杀菌剂，0.01、0.04、0.07、0.10 g/L 的代森锰锌。增殖与生根共48 个处理，每个处理分装10 瓶，重复3 次。抑菌剂添加完成后，搅拌均匀定量分装至干净并晾干水分的组培瓶中，放置7 d 后使用。对照培养基采用传统的高温高压灭菌方式，灭菌后放置7 d再使用。

1.2.3 开放式培养接种

选择干净、整洁的房间作为接种室，接种前用紫外灯照射0.5 h。接种器具的消毒和接种操作与传统香蕉组培接种方式相同。增殖芽每瓶接种6个芽丛，每丛2～3 个芽，共24 个处理，每个处理接种10 瓶，重复3 次；生根苗每瓶接种10 株，共24 个处理，每个处理接种10 瓶，重复3 次。

1.2.4 数据处理

污染率、增殖系数、褐变率和生根率用Mis‐crosoft Excel 2016进行统计分析，用SPSS17.0进行差异显著性分析。

污染率=污染瓶数/该处理接种瓶数×100%

增殖系数=增殖后总芽数/该处理接种总芽数

褐变率=褐变芽数/该处理接种总芽数×100%

生根率=生根植株数/该处理接种总植株数×100%

2 结果与分析

2.1 次氯酸钠在香蕉开放组培中的应用效果

次氯酸钠是一种常用的消毒剂。在香蕉的开放式组培中0.01%的浓度就具有良好的抑菌效果，此时的增殖系数为1.79，生根率为89.31%，根数也较多，但同对照相比，在增殖系数和生根率上存在较大差异（表1、图1）。当次氯酸钠浓度为0.02%时，组培苗基部褐变较严重，其增殖与生根的生长受到抑制，随着次氯酸钠浓度的提高，抑制效果越明显，当次氯酸钠浓度达到0.04%时，增殖苗与生根苗皆出现了死亡的情况。可见，采用次氯酸钠为香蕉开放组培的抑菌剂时，其浓度不应超过0.01%，否则其增殖与生根生长皆会受到影响。

2.2 植培灵在香蕉开放组培中的应用效果

植培灵是植物开放组培专用的一种植物源抑菌剂。在试验浓度处理下，0.10%浓度的植培灵能保证香蕉组培苗在开放式培养中不受细菌污染，真菌污染率为6.67%；0.35%和0.45%的植培灵虽然抗菌效果好，但会影响香蕉组培苗的生长；0.45%浓度植培灵处理的香蕉组培苗褐变情况的情况较严重，增殖生长也明显受抑制，生根率只有72.37%；效果最佳的浓度为0.25%，虽然香蕉组培苗的基部有轻微褐变的情况，但并不影响其生长，且没有污染的情况出现（表1、图1）。

表1 不同种类和浓度的抑菌剂在香蕉开放组培中的应用效果

图1 不同抑菌剂种类和浓度对香蕉增殖芽生长影响

2.3 益培隆在香蕉开放组培中的应用效果

益培隆作为一种植物开放组培专用抑菌剂，与微生物接触后，可使细胞死亡，从而迅速杀灭或抑制其生长。本试验结果表明（表1、图1），在香蕉的开放式组培中其抑菌效果差，对香蕉组培苗具有严重的毒害作用。在浓度为0.03%时，污染率高达93.67%，且香蕉组培苗严重褐变、生长受阻；当浓度为0.05%时，接种7 d 香蕉组培苗就开始出现死亡的情况；浓度为0.20%时，接种7 d 香蕉组培苗就已全部死亡。可见，益培隆不适合于香蕉的开放式组培。

2.4 清菌易在香蕉开放组培中的应用效果

清菌易随着浓度的提高，其抑菌效果越明显，但只对真菌有效，对细菌抑制效果差。0.03 g/L浓度的清菌易接种7 d 就出现污染的情况，且此时香蕉增殖芽只生长不增殖，生根苗尚未开始生根就已全部污染死亡了；当清菌易浓度为0.06 g/L 和0.12 g/L 时，其污染率分别为76.33%和53.33%，此时的增殖苗也只生长不增殖，生根苗未污染的植株可以生根，但生根数较少；当抑菌剂浓度达到0.18 g/L 时，还有40.71%的污染率，且植株出现褐变的情况，增殖芽只生长不增殖，未污染的生根苗基本都可以生根，只是生根数较少（表1、图1）。

2.5 S106杀菌剂在香蕉开放组培中的应用效果

随着S106 杀菌剂浓度的升高，抑菌效果越明显（表1、图1）。0.05%的浓度可完全抑制污染的发生，只是植株褐化较严重，芽的增殖生长与伸长生长也受到抑制；0.07%的浓度时，褐变和生长受抑制情况越明显；0.01%和0.03%的浓度虽然增殖与生根生长正常，但增殖芽偏白，且细菌污染率过高，分别为66.67%和28.52%。可见，低浓度的S106 杀菌剂抑菌效果差，高浓度时毒害作用明显，不适于香蕉的开放式组培。

2.6 代森锰锌在香蕉开放组培中的应用效果

代森锰锌是一种安全的广谱性抑菌剂，随着浓度的升高，其抑菌效果越明显，但总体的抑菌效果较差。浓度为0.01 g/L 时，在培养基制作完成7 d 内就已全部出现细菌污染；0.04 g/L 的浓度在接种一周后也全部出现了细菌污染；0.07 g/L的浓度，虽然起到了一定的抑菌效果，香蕉组培苗的生长也正常，可污染率过高，为34.36%；抑菌效果最好的浓度为0.10 g/L，但细菌污染率依然高于10%，且此时增殖芽偏白，不利于香蕉芽的增殖生长，不过生根生长正常，生根率为100%，且生根数较多（表1、图1）。

3 讨论与结论

3.1 讨论

试验表明，抑菌剂浓度越高，抑菌效果越好，不过当浓度达到一定限度后会影响香蕉组培苗的生长，这与王赵玉等［19］的观点一致，因此，在选择抑菌剂的时候要综合考虑抑菌效果和抑菌剂对香蕉组培苗生长的影响。

研究发现，有些抑菌剂完全不适于香蕉的开放式组培，不仅污染率高，且严重影响了香蕉组培苗的生长，比如益培隆、清菌易、S106 杀菌剂和代森锰锌。益培隆在浓度为0.03 g/L 时，香蕉组培苗就出现严重的褐化和生长受抑制的现象，当浓度进一步提高时甚至出现了死亡的情况，这可能是由于益培隆中含有某种成分对香蕉组培苗具有毒害作用，使其出现褐化甚至死亡的情况；清菌易在0.03 g/L 时，虽然增殖生长完全受到抑制，但生根生长却不受影响，可能是清菌易中含有抑制6-BA 活性的物质，使6-BA 无法进入细胞中发挥作用或降解失活了，导致香蕉组培苗的增殖生长受到抑制。S106 杀菌剂在低浓度时，不仅抑菌效果差，且增殖芽出现偏白的情况，随着浓度的升高虽然抑菌效果越明显，当浓度为0.05%时，虽然没有出现污染的情况，但此时组培苗褐化情况严重，生长严重受到抑制。因此，S106 杀菌剂也不适合香蕉的开放式组培。代森锰锌作为一种安全的广谱抑菌剂，低浓度时抑菌效果差，在培养基配置好7 d 内就已经全部细菌污染了，可能在该浓度范围内只对真菌有效，细菌则达不到抑菌效果。当浓度为0.10 g/L 时，虽然抑菌效果较好，但出现了增殖芽偏白的情况，这可能与代森锰锌中所含的Mn 元素有关，虽然Mn 有助于植物的光合作用，但Mn 含量过高反而会使净光合速率下降，影响植株的生长发育［20］，所以0.10 g/L 的浓度使增殖芽出现偏白的情况。

次氯酸钠作为一种常用消毒剂，有氧化和氯化作用，多用于水的净化，主要消毒原理是通过氧化细菌蛋白质，破坏细胞壁及自身代谢并死亡。目前已经有关于次氯酸钠在香蕉开放中应用的报道［21］，研究结果基本与本试验一致，0.01%的次氯酸钠在香蕉开放组培中抑菌效果良好，但在增殖系数上存在较大的差异，这可能与接种手法、培养基配方等存在差异有关。

供试的几种杀菌剂中，植培灵在0.25%的浓度就可很好的抑制污染的发生，且此时的增殖系数和生根率最高，增殖系数为2.22，生根率为93.33%，与对照的差距最小。0.10%的植培灵次之，虽然细菌污染率为6.67%，不过该污染率在5.0%左右，且没有真菌污染，从植物组培工厂化生产的角度考虑在可接受范围内。可见，植物源类的抑菌剂在植物开放式组培中具有较大的优势，不仅抑菌效果良好，且对组培苗生长的影响最小。

3.2 结论

在香蕉组培的增殖和生根阶段中，抑菌剂浓度越高，抑菌效果越好，但益培隆、清菌易、S106 杀菌剂和代森锰锌完全不适合于香蕉的开放式组培，在低浓度时不仅抑菌效果差，且组培苗褐化、生长受抑制现象明显，高浓度时甚至会导致香蕉组培苗出现死亡的情况。次氯酸钠和植培灵的抑菌效果好，在低浓度时即可抑制污染的发生，但次氯酸钠对香蕉组培苗增殖和生根生长的效果不如植培灵。综合抑菌效果和对香蕉组培苗生长的影响，植培灵更适合于香蕉的开放式组培，0.25%的浓度较佳，0.10%的浓度次之。