中国南瓜突变体库构建及表型变异的初步分析

闵子扬 韩小霞 李勇奇 胡新军 汪端华 孙小武

(1湖南农业大学园艺学院，湖南 长沙 410128；2湖南省农业科学院蔬菜研究所，湖南 长沙 410125)

中国南瓜(Cucurbita moschataD.)是南瓜属4 个栽培种之一，是葫芦科(Cucurbitaceae)重要的蔬菜作物，具有广泛的营养价值、药用价值和经济价值[1]。我国关于南瓜的研究以品种选育为主，基础研究较弱，许多农艺性状的遗传规律还不明晰，严重制约常规育种发展[2]。基因组学的迅速发展可打破常规育种局限，对目标性状基因的发掘和功能研究已成为基因组学研究的重点[3-4]。正向和反向遗传学方法对基因组进行分析是功能基因组学研究的两种有效途径[5]，而基因变异是基因组分析研究的基础。构建突变体库作为获得基因变异的重要途径，逐渐受到重视。

构建突变体库的方法主要包括物理、化学和生物诱变，其中理化诱变能够高效迅速地获得更多有价值的突变材料[6]。甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)是目前应用最广泛的化学诱变剂之一，它可直接诱发点突变，具有操作简便、高效、突变范围广、遗传稳定等优点，是目前构建突变体库的首选方法[7]。利用EMS 诱变技术已在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)[8]、水稻(Oryza sativaL.)[9]中构建了饱和突变体库，并进行了相关基因的功能分析，明确了花期[10]、抗逆性[11-12]及矮化[13]等基因的功能，同时获得了一批有价值的种质资源。在蔬菜作物方面，目前已在黄瓜(Cucumis sativusL.)[14]、西瓜[Citrullus lanatus(Thunb.)matsum et Nakai][15]、甜瓜(Cucumis meloL.)[16]、辣椒(Capsicum annuumL.)[17]、大白菜[Brassica pekinensis(lour).Rupr.][18]等作物上构建了EMS 突变体库，为相关作物的基础研究和新品种选育做出了重大贡献。

2017年南瓜全基因组测序顺利完成[19]，使南瓜遗传育种的相关研究步入后基因组时代，构建南瓜突变体，深入系统研究南瓜相关功能基因势在必行。然而，目前国内外鲜见南瓜突变体库构建及相关研究的报道。本研究利用EMS 对中国南瓜高代自交系N87种子进行诱变处理以构建突变体库，对突变群体的表型变异情况进行筛选与分析，获得了与株型、花色、叶片、节间长、强雄等性状相关的突变材料，并进一步明确花色和短蔓突变为单基因隐性突变，以期，为中国南瓜功能基因组研究和新品种选育奠定材料基础。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

以中国南瓜高代自交系N87 种子为材料，由湖南省蔬菜研究所南瓜研究室提供。EMS 诱变剂购于美国Sigma 公司，为无色溶液，用0.1 mol·L-1pH 值7.0的磷酸缓冲液稀释成不同浓度。

1.2 试验方法

1.2.1 EMS 最佳诱变条件的筛选 将N87 种子在28℃温水中浸种4 h，28℃催芽12 h，然后在通风橱中将其浸入50 mL 不同浓度(0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%)的EMS 溶液中，以磷酸缓冲液(EMS 浓度为0)浸种为对照；期间，在28℃摇床上分别震荡10、12、14 h，处理结束后，在通风橱中将EMS 废液倒入废液桶，处理完成的种子在流水下冲洗8 h 后，将种子平铺于内覆湿润滤纸的培养皿中，并在28℃培养箱中催芽36 h，催芽结束后统计种子发芽率及发芽势，然后将种子播种于穴盘，7 d 后统计各处理的成苗率及植株苗期生长情况，综合评估以确定中国南瓜种子EMS 诱变的最佳处理条件。以上每处理100 粒种子，重复3 次。

1.2.2 中国南瓜突变体库的构建 2018年春季，将10 000 粒饱满、大小均一的中国南瓜N87 的种子采用筛选的最佳诱变条件进行诱变处理，将处理后发芽的种子播种至穴盘内进行育苗。4月中旬定植于湖南省蔬菜研究所高桥科研基地，共成活3 960 个单株，构成中国南瓜突变体库M1群体；正常田间管理，严格自交授粉，共收获725 份单株自交瓜种子，每份种子记为1个M2株系。2018年秋季，从M2中随机选取98 个株系在海南三亚南滨农场进行种植，每株系定植16 株(不足16 株按实际株数种植)，共计1 432 个单株，构成中国南瓜突变体库M2群体，正常田间管理。

参照农业农村部中国南瓜DUS(特异性、一致性和稳定性)测试指南[20]，以野生型中国南瓜N87 为对照，分别观察M1、M2变异群体的形态特征，记录变异群体的叶色、叶形、叶片大小、株形、花色、瓜形、性别等性状。M2中发现的变异材料自交留种的同时与野生型杂交以构建分离群体，对相关变异性状进行遗传分析。

2 结果与分析

2.1 中国南瓜种子EMS 最佳诱变条件的筛选

由表1可知，EMS 浓度为0.8%时，种子的发芽率与对照相比有所提高，推测低浓度的EMS 能促进中国南瓜种子的发芽。在EMS 浓度大于0.8%时，随着诱变时间和EMS 浓度的增加，种子的发芽率和成苗率均呈现下降的趋势，表明EMS 诱变能够导致中国南瓜种子的死亡。在1.6% EMS 浓度下处理12 h 时，种子的发芽率为59%，芽势较弱，成苗率为65%，幼苗生长缓慢、真叶皱缩，综合成苗率为38.40%(图1-A、B、C、D)，在发芽率接近半致死的同时还可保证一定的成苗率；磷酸缓冲液处理12 h 后表现为发芽率93%，芽势强，成苗率93%，苗期生长旺盛、真叶平展(图1-a、b、c、d)。综上确定1.6% EMS 处理12 h 是中国南瓜种子最佳的诱变处理条件。

表1 不同浓度EMS 和处理时间对中国南瓜种子发芽率和成苗率的影响Table 1 Effects of concentration of EMS and treatment time on germination and survival rate of pumpkin seeds

2.2 中国南瓜突变体库M1 群体的表型变异分析

2018年春季，将1.6% EMS 处理12 h 后发芽的种子播种至穴盘内进行育苗，最终田间成活3 960 个单株，构成中国南瓜突变体库M1群体。M1群体中出现了很多表型变异，但这些变异很多是化学药害造成的，属不可遗传的变异，因此本研究对M1群体只进行观测而未进行筛选。M1群体正常田间管理，严格自交授粉，由于EMS 处理后的很多植株表现出叶片黄化、白化、叶片皱缩、植株簇生、雌花畸形、花粉败育、花期不遇等情况，自交授粉率低，M1群体只收获725 个单株自交瓜种子，记为M2。

2.3 M2 群体田间性状调查及部分突变性状分析

2018年秋季在三亚南滨农场种植M2的98 个家系，每个家系种植16 株，部分单株不足16 株，共计1 432 个单株，自交留种，同时把突变体与野生型进行杂交。调查发现，M2突变材料中总体表型突变频率为11.20%，主要包括叶色、叶形、叶片大小、花色、花期、雌花节位、单性结实、株型、蔓长、果形等变异(表2)。

2.3.1 M2群体真叶突变表型变异分析 野生型中国南瓜材料N87 的真叶近掌状，边缘缺裂中等，上覆白斑，叶色深绿(图2-A)。M2群体中的真叶变异主要表现在叶形和叶色两方面，其中叶形有叶片小而尖、叶色淡绿(图2-B)；叶片近圆形(图2-C)；叶缘细锯齿状且内卷(图2-D)；叶片小而皱缩、缺刻极深、叶色浓绿(图2-E)等突变材料出现；叶色方面，出现了叶色淡绿(图2-F)；全白色(图2-G)；浅黄色上覆白斑(图2-H)；深黄色(图2-Ⅰ)；浅黄色与绿色不规则嵌合(图2-J)；浅黄色与绿色规则嵌合(图2-K)；生长点黄化后逐渐又转为绿色等突变材料(图2-L)。叶片变异是在M2群体中突变频率较高的一种类型，其突变频率为4.55%，占总突变频率的40.63%。

2.3.2 M2群体株型突变表型变异分析 野生型南瓜N87 属中国南瓜类型，主蔓长约3.5 m，叶片长约28 cm、宽约26 cm，上被白斑、叶色深绿，主生长点明显，主蔓节间长约23 cm(图3-A)。M2群体中株型突变主要表现为植株生长瘦弱、叶片变小(图3-B)；植株叶片生长紧凑、叶柄与主蔓夹角变小(图3-C)；植株叶片浅绿、主蔓无法正常伸长(图3-D)；叶片皱缩无法正常展开、植株呈鸡爪状(图3-E)；植株簇生无生长点(图3-F)；花打顶(图3-G)；植株节间长变短、呈半蔓生状(图3-H)。株型变异频率仅次于叶片变异频率，其突变频率为2.31%，占总突变频率的20.63%。

表2 中国南瓜突变体库M2 群体表型变异情况Table 2 Statistic of mutant type of M2 generation in pumpkin mutation library

2.3.3 M2群体生殖器官突变表型变异分析 野生型南瓜花冠颜色为橙黄色(图4-A)，雄花柱头细长、上被花粉，雌花花冠能够正常打开、子房大小正常。M2生殖器官变异主要表现为花冠颜色变浅、呈白色(图4-B)；雄花柱头短缩、无花粉(图4-C)；雌花花冠不能正常打开、子房变态膨大、可单性结实等现象(图4-D)。生殖器官变异在M2群体中突变频率为2.10%，占总突变频率的18.80%。

2.3.4 M2群体果实突变表型变异分析 野生型中国南瓜N87 为高代自交系，其果实长纺锤形、果长约24 cm、宽约20 cm、无明显果柄、浅棱、成熟果深黄色、上覆蜡粉、一致性好(图5-A)。M2群体中出现了很多果型变异的情况，主要表现为果长变短呈扁圆形(图5-B)；高圆形(图5-C)；正圆形(图5-D)；果长与野生型基本一致、但果实变粗呈近高圆形(图5-E)；果柄和底部收窄变尖(图5-F)；果长变长呈长圆筒形(图5-G)；有瓜把和种腔膨大(图5-H)。果型变异在M2群体中突变频率为2.24%，占总突变频率的20%。

2.4 花色与短蔓突变性状的观测与遗传分析

M2群体中很多具有突变性状的植株，无法收获自交种子，导致无法进行突变性状的M3验证。目前已通过M3和F2分离群体验证，明确为稳定可遗传变异的有白花突变(图6-B)和短蔓突变(图6-D)，卡方测验结果表明(表3)，这2 个性状F2的分离比均符合3∶1，为单基因隐性突变。

表3 2 个突变性状的卡方值计算表Table 3 Two mutants χ2 worksheet

3 讨论

3.1 诱变条件与建立高效突变体库

EMS 诱变技术广泛应用于作物突变体库的构建，目前已在水稻[20]、大豆[21]、玉米[22]、番茄[23]、甘蓝[24]、黄瓜[25]等作物上成功构建突变体库，并在功能基因组学研究上发挥了巨大作用。作物EMS 诱变过程中，寻找半致死剂量(LD50)是关键的步骤[26]，对突变体库的高效构建至关重要，但由于作物种类、品种甚至是诱变部位的不同，EMS 诱变的最佳处理浓度和时间差别较大。黄萍等[27]以马铃薯愈伤组织为材料，确定0.8% EMS 处理4 h 可达到较好的半致死效果。卢银等[18]以大白菜种子为材料，确定0.4% EMS 诱变处理16 h 为大白菜种子EMS 诱变的半致死剂量。张兵[28]用LD50为指标确定山农5 号黄瓜的EMS 最佳诱变条件为1% EMS 处理22 h。本试验以中国南瓜高代自交系种子为材料，以半致死率为最佳诱变条件的筛选标准，发现中国南瓜种子用1.6% EMS 处理12 h时，其发芽率为59%，成苗率为65%，M2总体表型突变频率达11.20%，利用此方法进行中国南瓜突变体库的构建，既可产生较高的突变频率，又可保障突变体库具有一定的规模。

3.2 中国南瓜突变体库M2 表型变异调查与固定

本研究利用1.6% EMS 处理10 000 粒中国南瓜种子12 h 时，获得了由3 960 个单株组成的M1群体，对M1群体进行全生育期观察发现，该群体在苗期存在发芽缓慢、真叶皱缩，叶片黄化、白化、叶色嵌合，叶片细小或无法正常展开、植株矮小，生殖器官退化等变异现象，这与前人的研究结论一致[28-29]。由于M1中很多变异是化学药害造成的假突变，因此无需对M1进行选择，但有必要进行观测，一方面可以通过M1的变异情况评估诱变效果，另一方面为M2突变材料的筛选提供必要指导。M1代全部自交留种，共收获725个单株自交瓜种子，记为M2。

每份M2种子记为一个家系，每家系种植16 株进行表型变异的观察，由于南瓜种植所需面积大且需单株自交授粉，目前本试验只对98 个家系进行了观测，发现M2总突变频率达11.20%，在株形、叶片大小、果形、花色等方面获得了一批稳定遗传的突变材料。本试验仍剩余627 个家系未进行筛选，基于已筛选家系的突变频率推测，预期将获得很多突变材料，可为下一步进行相关基础研究及新品种选育提供材料研究基础。

3.3 突变性状的遗传分析是突变体进一步研究利用的基础

EMS 诱变是非定向的，产生的突变材料在育种上是否有应用价值需要在生产实践中进一步检验，但这些突变材料在相关基础研究中意义重大，对突变性状进行遗传分析是进行相关基础研究的前提。M1中出现了很多叶色嵌合、叶片形态变化、生殖器官退化等表型，但是这些表型在其M2株系中大部分恢复正常，这与前人的研究结论一致[30]。一般情况下，EMS 导致的点突变往往导致基因的失活，假如突变位点为表型相关基因，则在M2株系中会出现突变的隐性表型[31]。本试验在M2中发现很多表型突变材料，经M3验证能够稳定遗传的有以下几种:花色突变材料，该材料可作为标记性状应用于南瓜的杂交制种过程、开发新型制种模式；短蔓突变材料节间长变短、半蔓生，株形紧凑，是培育短蔓品种的理想材料；强雄与单性结实突变材料，强雄材料45 节内无雌花、单性结实突变材料雌花花冠无法正常打开但可正常坐果，这两个材料对研究南瓜性别意义重大。本研究后续将从这些性状的基因定位等方面开展工作，进而提高中国南瓜的基础研究水平。

本研究突变体库数量较大且南瓜突变体筛选相对困难，在突变性状的鉴定中，本试验只对表型变异进行了鉴定，而其他一些与育种关系密切的性状，如果实淀粉含量、纤维素含量、抗逆性等未进行筛选，下一步将加强这些方面的筛选工作，同时做好已获得突变材料的基础研究争取获得更多能够应用于育种实践的突变材料。

4 结论

本研究确定了中国南瓜高代自交系N87 种子EMS 诱变的最佳条件为1.6% EMS 处理12 h，该处理下种子发芽率为59%。构建了由725 个M2家系组成的中国南瓜突变体库，M2总体表型突变频率达11.20%。通过该突变体库筛选到了一些能够稳定遗传的突变材料，其中花色突变材料、短蔓突变材料、单性结实突变材料、强雄突变材料有望在南瓜轻简化栽培上发挥重要作用。另外，本研究确定了花色突变和短蔓突变为单基因隐性突变所致，相关基因的定位工作正稳步推进。