湛江等鞭金藻藻际细菌群落与其耐高温关系分析

陈 珂 王莹莹 杨 悦 曹嘉懿 曹旭鹏 徐继林

(1宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211；2中国科学院大连化学物理研究所催化基础国家重点实验室，辽宁 大连 116023)

海洋微藻具有生长周期短、生物量产率高、营养组成丰富、培养占地面积小等特点，近年在养殖饲料、生物能源、生态治理、食药保健等领域备受关注[1-3]。湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)作为一种无细胞壁、易培养且营养价值特殊(富含二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸)的海洋微藻，在水产养殖领域已有大规模的应用[4]，尤其在我国南方的大规模海水贝类工厂化育苗中，其作为一种重要的海水贝类幼苗开口饵料应用[5-7]。金藻的最适宜生长温度为25℃[8]，然而我国南方夏季藻类培养池水体温度能达到35℃[9]，夏季高温严重制约了金藻的生长和扩繁，从而导致较高的生产成本和风险。

目前已有关于藻类高温响应机制的研究，如在多细胞藻类海带中发现细胞膜结构对高温存在响应，高温使海带体内的活性氧含量增高，细胞膜的通透性增加，从而影响到海带细胞体内的抗氧化系统活性[10]；在石莼中，热激应答元件(heat shock element，HSE)和低温响应元件(low temperature responsive element，LTR)因子可能是适应高温潜在分子热激蛋白70 基因(hsp70)的靶点，其下游的靶基因所编码的热激蛋白会对细胞器的膜系统稳定性和功能加以保护[11]；在微藻细胞中，高温抑制了光系统Ⅱ(PS Ⅱ)的电荷分离活性，钝化了PS Ⅱ的氧化能力[12]。研究还发现，微藻藻际微生物组成与藻类生长之间存在重要联系，它能够参与调控藻类的生长、营养组成、代谢产物分泌等重要的生命活动[13-15]。进一步研究发现，高温胁迫条件下原核微生物与其共生藻类形成的微环境能为珊瑚宿主提供一种适应高温胁迫的补偿机制，这些原核微生物能够通过光合作用、固定碳源等方式增强珊瑚本身的耐热性[16-17]。且目前已在番茄和高粱中发现，根瘤菌可以增强植物高温抗逆性[18-19]。但在微藻耐高温性状与其藻际微生物群落间关系方面的研究仍然有限，因此解析藻际细菌与微藻耐高温能力之间关联的研究具有重要意义。本试验以湛江等鞭金藻及其耐高温诱变株为研究对象，运用16S rDNA 扩增子测序技术比较了这两株藻在高温条件(35℃)下藻际微生物组成的差异，解析微生物组成与耐高温能力的关系，以期为提高水产养殖过程中饵料微藻的高温抗逆性提供参考。

1 材料与方法

1.1 藻种及培养条件

湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis，IZ)，保藏编号为FACHB-1750，由中国科学院水生生物物种种质库提供。湛江等鞭金藻耐高温诱变株(IM)由中国科学院大连化学物理研究所采用常压室温等离子体技术诱变筛选获得[20]。两株湛江等鞭金藻在无菌宁大三号(NMB3＃)固体培养基纯化并保存[21]。

两株金藻均培养在光照培养箱中，置于正常培养温度(25℃)和高温(35℃)下培养，光照强度为4 000 lx，光周期为光∶暗=12 h∶12 h。培养基采用NMB3＃配方培养基，培养所需海水均高温灭菌处理冷却后使用。

1.2 藻细胞生长曲线测定及样品采集

藻细胞计数主要采用血球计数法[22]。将藻液用卢戈碘液固定后取40 μL 混匀的藻液均匀滴入盖有盖玻片的血球计数板中，放置在光学显微镜(Olympus，日本)观察并计数，目镜放大10 倍，物镜放大40 倍，每天计数一次。

根据两株金藻的生长情况，分别在25℃和35℃条件下取第3 天指数生长时期的藻液50 mL，收集25℃野生株组(IZ25L)、25℃诱变株组(IM25L)、35℃野生株组(IZ35L)和35℃诱变株组(IM35L)藻液，各组分别收集3 个重复样品。将所有样品依次通过0.22 μm的聚碳酸酯膜(Millipore，美国)进行无菌过滤，获得藻际细菌，将收集好的滤膜分别放置于不同的无菌离心管中液氮速冻保存。

1.3 样品基因组DNA 的提取及PCR 扩增与高通量测序

采用CTAB 法对所有样本的基因组DNA 进行提取，提取后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的纯度和浓度。将获得的合格基因组DNA 送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行后续PCR 扩增及测序。以稀释后的基因组DNA 为模板，选择各样本总DNA 上16S rDNA 基因的V3-V4 高变区序列扩增，使用带Barcod的引物 341F (CCTAYGGGRBGCASCAG) 和 806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT)进行PCR 扩增。PCR产物使用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物的浓度将样品进行等量混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，使用德国QIAGEN 公司胶回收试剂盒回收目的条带的产物。文库构建使用 TruSeq©DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建库试剂盒(诺禾致源，北京)进行，而后通过Qubit(Thermo Scientific，美国)检测和Q-PCR(quantitative real-time PCR)定量构建合格文库进行测序。

1.4 测序数据处理与分析

基于Illumina NovaSeq 测序平台，利用Qiime 软件对原始下机数据进行过滤，得到质量较高的有效数据[23]。利用Uparse 软件将所有样本的有效数据进行操作分类单元(optional taxonomic unit，OTU)聚类，同时筛选聚类相似度为97%[24]中出现频率最高的OTU作为其代表序列。采用Mothur 方法对获得的OTU 代表序列进行物种分类学处理(设定阀值为0.8)，参照SILVA 的SSUrRNA 数据库进行物种比对注释[25]，注释时删除古细菌、叶绿体和未知序列。为消除因测序深度不同引起的样本间多样性评估偏差，对各样本的数据进行均一化处理，以其中数据量最少的样本为标准进行均一化处理，后续基于均一化处理的数据进行Alpha 多样性分析和Beta 多样性分析。

1.5 藻际可培养细菌分离与鉴定

将生长状态良好的藻液按照藻液∶培养液=1∶9(体积比)的比例进行稀释，稀释至细胞密度为10-1～10-5，取100 μL 的各稀释浓度样品用平板涂布法均匀涂布在2216E 固体平板培养基上。将平板放置于28℃恒温培养箱内培养数日，每日观察平板的细菌生长情况(菌落颜色、形态和大小)，再挑取可操作的单一菌落置于新的2216E 固体培养基中进行划线法纯化，最终得到单克隆菌株。

对分离所获得的各菌株，采用细菌基因组DNA 提取试剂盒分别进行提取。以提取后的总DNA 为模板，27F(5′-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)为引物进行PCR 扩增，扩增反应体系及条件参考孔周雁等[26]的方法。将PCR 扩增后的产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用凝胶回收试剂盒纯化，并连接至pMD19-T 载体后送至杭州有康生物技术有限公司测序。将从公司所测得的16S rDNA 基因序列全长输入NCBI 网页进行BLAST 比对同源相似性最高的物种序列。

1.6 统计分析

MetaStat 分析使用R 软件在种水平下，做组间的置换检验，得到p 值，然后利用Benjamini and Hochberg False Discovery Rate 方法对于p 值进行修正，得到q值[27]。利用SPSS 软件进行统计分析，对湛江等鞭金藻生长指标进行独立样本t检验。

2 结果与分析

2.1 高温条件下湛江等鞭金藻野生株和突变株生长差异比较

在25℃和35℃条件下野生株IZ 与诱变株IM 之间的生长曲线如图1所示。由图1-A 可知，在25℃培养条件下，野生株与诱变株生长趋势基本相同，且藻的细胞密度无显著差异；在35℃培养条件下，野生株与诱变株生长趋势基本相同，但诱变株IM 每天的藻细胞密度高于野生株IZ，且在第4～第10 天差异显著，说明在35℃下诱变株IM 的高温耐受性明显强于野生株IZ。

2.2 高通量测序数据统计与分析

4 组样品测序共计获得804 756 条有效序列，组间平均有效序列获得率为69.64%～75.20%，表明各组测序结果能基本反映各组样本中的大多数细菌类群情况(表1)。在指数生长期，25℃下两株藻细菌类群的Chao1 指数和ACE 指数无显著性差异，但诱变株的藻际细菌类群的Shannon 指数和Simpson 指数显著高于野生株；35℃下两株藻细菌类群的Shannon 指数和Simpson 指数无显著性差异，但诱变株的Chao1 指数和ACE 指数显著高于野生株。这说明指数期温度升高可促使诱变株藻际细菌丰富度显著增加。

OTU 聚类结果显示4 组样本中共有OTU 数量为87 个，其中IM35L 组中的特有OTU 数量远高于其他组别(图2)，进一步说明该组的藻际细菌丰富度最高。

2.3 藻际细菌群落多样性分析

表1 各样品组所检测到的有效数据及多样性指数Table 1 The effective tags and diversity indices of each sample group

在OTU 水平上，基于Binary-Jaccard 距离对所有样本进行无度量多维标定法(non-metric multidimensional scaling，NMDS)分析，其中横坐标为MDS1，纵坐标为MDS2，且该NMDS 的Stress 值为0.086，小于0.2，说明NMDS 可以准确反映样本间的差异程度(图3)。在MDS1 维度中四组样品点，组内样品差异基本小于组间样品差异，能够较为直观地反映四组样品间的差异。25℃下两株金藻样本点聚集在MDS1 的负半轴，且整体较为聚集，说明25℃下两株金藻的藻际细菌群落多样性较为相似。但35℃下，IM 和IZ 样本点分别位于MDS1 的正负半轴且两组样本点组间较为离散，说明35℃下两株金藻的藻际细菌群落多样性有明显差异。说明高温条件下两株藻藻际细菌存在明显差异。

2.4 藻际细菌群落组成差异及比较分析

在门水平上(图4-A)，各组样品检测到的优势菌种有一定的相似性，各组样品均以变形菌门(Proteobacteria) 为主要优势菌门，其相对丰度达91.57%～97.01%；其次为拟杆菌门(Bacteroidetes)，相对丰度达1.54%～6.28%，其他优势菌种还包括厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)等。

在属水平上(图4-B)，经检测后四组样品中细菌群落组成差异明显。除未知属外(Others)，IZ25L 组、IM25L 组和IZ35L 中相对丰度最大的前三属相同，为海杆菌属(Marinobacter)、拉布伦茨氏菌(Labrenzia)、海洋柄菌属(Oceanicaulis)；而IM35L 组中相对丰度最大前三属分别是拉布伦茨氏菌(Labrenzia)、海洋柄菌属(Oceanicaulis)和噬冷菌属(Algoriphagus)，这说明噬冷菌属在该组中的相对丰度明显提高，隶属于该属的细菌可能与IM 的耐高温性状有关。

2.5 藻际细菌群落间差异物种分析

为了研究组间具有显著性差异的物种，利用MetaStat 方法对组间的物种丰度数据进行假设检验得到p 值，通过对p 值的校正，得到q 值，最后根据q 值经过t 检验筛选得到具有显著性差异的两株菌种。其中，在35℃下，变形菌门红螺菌目的阿尔法变形菌DG1252(Alpha proteobacteriumDG1252)在诱变株中的丰度显著高于野生株，但在25℃下丰度差异不显著，说明变形菌门的阿尔法变形菌DG1252 在高温条件可能为促进湛江等鞭金藻诱变株生长的重要菌种；聚团拉布伦茨氏菌(Labrenzia aggregata)在25℃下两株藻之间丰度差异显著，但在35℃下菌种丰度差异不显著。

2.6 湛江等鞭金藻野生型和诱变型藻际可培养细菌的分离和鉴定

使用培养基配方为2216E 的平板进行涂布平板分离法对两种藻株的藻际细菌进行分离，经过初步分分离和鉴定得到4 株野生型的藻际细菌(编号为IZ-1、IZ-3、IZ-4 和IZ-5)和5 株诱变型的藻际细菌(IM-1、IM-2、IM-3、IM-4 和IM-5)，细菌信息及比对相似度如表2所示。其中，分离得到的海杆菌和噬冷菌等均为藻际细胞的主要细菌群落。因此，分离得到的细菌与测序分析获得的结果基本一致，一定程度上验证了测序结果的可靠性。

表2 从湛江等鞭金藻野生株(IZ)和湛江等鞭金藻诱变株(IM)分离的藻际细菌信息Table 2 The information of bacteria isolated from wildstrain I.zhangjiang(IZ) and mutant strain I.zhangjiangensis(IM)

3 讨论

通过比较湛江等鞭金藻野生型和诱变型藻株在25℃和35℃的生长情况，发现两株藻在25℃条件下的生长差异并不明显；但在35℃条件下，诱变株的生长情况明显优于野生型。已有很多研究发现藻际微生物对微藻至关重要[14，28-29]，然而鲜有研究解析其是否与微藻耐高温能力存在关联。因此，本试验以湛江等鞭金藻及其耐高温诱变株为研究对象，运用16S rDNA扩增子测序技术比较了这两株藻在正常培养温度(25℃)和高温条件(35℃)下藻际细菌组成的差异，解析了藻际细菌组成与耐高温能力的关系。

两株湛江等鞭金藻在不同温度条件下藻际细菌门水平组成上较为相似，其中主要优势菌门是变形菌门和拟杆菌门，其次是拟杆菌门和厚壁菌门。目前已有研究发现变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门是藻际细菌群的重要菌群组成[26，30-32]。另外，对比不同温度下的属水平细菌组成发现，海洋柄菌和Glycocaulis的相对丰度在35℃下普遍高于相对应的25℃。这在微小亚历山大藻中也有同样的发现，温度升高对其藻际细菌群落改变的主要表现之一就是海洋柄菌的细菌丰度提升了17%[33]；Abraham 等[34]研究发现一种与海洋柄菌亲缘关系最接近、适宜30℃的耐高温Glycocaulis细菌，这也验证了本研究在高温下发现的属水平藻际细菌群落差异。另外，本研究发现上述两个差异属在上一级的分类单位中属于同一科(生丝单胞菌科，Hyphomonadacea)，而近年来全球变暖的情况导致了该科水平细菌在海洋中的丰度上升[35]。藻际细菌组成在属水平上差异较大，主要是IM35L 组中噬冷菌属细菌相对丰度明显高于其他三组。因此温度的升高会造成水体中藻际微生物群落的变化，结合两株藻在25℃和35℃下的生长情况来看，噬冷菌属细菌的相对丰度差异可能是湛江等鞭金藻诱变株在35℃下生长更好的原因之一。

为进一步分析35℃下两株藻间生长差异，明确具有显著性差异的细菌物种，采用MetaStat 方法对所有组间差异物种在种水平上进行分析，发现除未知种外在组间具有显著性差异丰度的细菌共计两种。其中变形菌门红螺菌目细菌阿尔法变形菌DG1252 在25℃下野生株组和诱变株组的丰度无明显差异，但在35℃下诱变株组的丰度显著高于野生株组。目前已有研究表明该目的模式物种深海红螺菌(Rhodospirillum rubrum)在71℃下仍能进行光合作用，且该现象在同一门水平都具有广泛的适用性[36]。因此推测阿尔法变形菌DG1252 在35℃下可能是提高湛江等鞭金藻诱变株高温耐受性的重要菌种。但该微生物在高温下能否增强藻类对高温的耐受性还有待深入验证。

本研究对两株藻的藻际细菌进行进一步分离与鉴定，分别从IZ 和IM 中分离鉴定了4 株和5 株藻际细菌，其中包括2 株噬冷菌属细菌，但未分离得到阿尔法变形菌DG1252，这可能是由于本研究采取单一的培养基分离藻际细菌具有一定的局限性，造成一些重要细菌未分离到。因此，为进一步解析这些细菌与湛江等鞭金藻耐高温性状的关系，需要增加分离细菌的培养基类型来鉴定分离更多藻际细菌；此外，将两株湛江等鞭金藻藻株先进行无菌纯化处理，再将除菌后的藻株与分离得到的噬冷菌属菌株进行共培养试验，有助于进一步验证其与湛江等鞭金藻耐高温性状的关系。

4 结论

本研究基于16S rDNA 扩增子测序技术，分析了湛江等鞭金藻野生株和诱变株藻际细菌多样性及其耐高温性状的联系。结果表明，25℃下两株藻的藻际细菌群落差异小，但在35℃高温下培养的两株藻藻际细菌群落组成差异明显。进一步分析发现，噬冷菌属细菌和阿尔法变形菌DG1252 在两株藻中的相对丰度在25℃下无显著差异，但在35℃下诱变株相对丰度显著高于野生株，两者可能与湛江等鞭金藻诱变株高温耐受性相关。此外，本研究分离并鉴定了包括噬冷菌属细菌在内的9 株藻际细菌，但未能分离阿尔法变形菌DG1252。后续可对藻际细菌进行分离鉴定并进行共培养试验，以验证其与湛江等鞭金藻耐高温性状的关系。本研究为金藻高温抗逆性和藻际细菌多样性的关系探索提供了新方向，有助于夏季高温条件下水产养殖过程贝类饵料微藻的培育和扩繁。