脑转移及动物模型制备的研究进展

赵 峰，杨林杰,2，周晓坤，吕 良*

（1.桂林医学院药学院药理教研室，广西 桂林 541199；2.广西医科大学第一附属医院病理科，广西 南宁 530021；3.桂林医学院附属医院神经外科，广西 桂林 541001）

恶性肿瘤脑转移（brain metastases）被认为是肿瘤进展过程中的晚期事件，对患者的生存质量和生存进程有着破坏性的影响。所有部位恶性肿瘤发生脑部（包括脑实质与脑膜）转移的总发病率约为10%，常见发生脑转移的恶性肿瘤包括：肺癌、乳腺癌、黑色素瘤及肾癌[1]。研究表明[2]，随着分子靶向药物的治疗，肝癌等的肿瘤患者生存时间得到延长，脑转移的发病率也呈上升的趋势。脑转移的治疗是棘手的，目前的治疗方式以手术、全脑放疗、立体定向放射治疗及化疗为主，但均是姑息性的，预后仍然很差[3]。建立理想的脑转移动物模型对于脑转移发生发展机制的探究与治疗药物的研发具有重要的意义，本文概述脑转移发生的机制，并就脑转移动物模型的制备方式、应用及进展作一综述。

1.脑转移机制概述

经典的“种子与土壤”假说认为，作为“种子”的肿瘤细胞，只有那些增殖能力强、更具迁移力和侵袭力的肿瘤细胞可以成功实现脑部的转移。有研究[4]将相匹配的原发灶与转移灶内肿瘤细胞进行基因检测比较，证实尽管转移灶与原发灶的肿瘤同源，但是存在有部分基因扩增或缺失、过度表达或激活、表达不足或失活，说明肿瘤细胞在转移部位发生了独特的改变。这些转移灶内发生的与其原发部位不同的基因型改变的包括有CDKN2A和PIK3CA的不同突变、PTEN的丢失、ERBB2的扩增等，这些基因改变涉及细胞增殖、生长和生存的调控。作为“土壤”的脑部定植部位，通过细胞信号传导途径，使局部微环境发生改变，如引发炎症反应、增加血管内皮通透性、破坏血脑屏障功能、促血管生成等。

血行转移是其主要转移途径，如图1所示，一般会经历：肿瘤细胞从原发灶分离、侵入血管、通过血液循环运输、到达脑部并渗出血管、脑组织内定植生长。

图1 恶性肿瘤脑转移一般过程简图

转移级联过程涉及复杂及串扰的分子机制。首先，肿瘤细胞通过主要由转化生长因子-β通路（TGF-β）参与调控的上皮细胞-间充质转化（EMT）获得间质细胞所具有的迁移和侵袭能力从原发部位脱离[5]，继而富集在血管周边的巨噬细胞分泌细胞因子，这些因子以血管为中心扩散，从而形成了一个指向血管的浓度梯度，从原发灶脱落的肿瘤细胞可以沿着这一浓度梯度向血管作趋化运动[6]。在这一过程中，血管附近巨噬细胞分泌的EGF，肿瘤细胞分泌的CSF-1等趋化因子发挥了重要作用。在血液循环系统中，血小板为肿瘤细胞的存活提供了保护，它会粘附于肿瘤细胞表面形成血小板-肿瘤细胞聚合体，使肿瘤细胞逃避免疫识别[7]。肿瘤细胞到达脑部，被毛细血管截留（循环停止），被认为是其主要的捕获机制[8]。

脑部具有其独特的解剖、代谢、免疫微环境，神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞等是其主要细胞成分，血脑屏障（BBB）、血脑脊液屏障（BCSFB）是中枢神经系统的守门人，通过封闭脑毛细血管内皮细胞或特殊的上皮和软脑膜细胞的紧密连接的作用，保护大脑免受大规模炎症的潜在致命后果[9-10]。既往大脑被认为是免疫特权器官的场所，事实上，现在已经证实肺癌、乳腺癌、黑色素瘤和肾癌患者脑转移中存在肿瘤浸润性T淋巴细胞[11]。此外，组织蛋白酶S被发现在乳腺癌患者的脑转移中表达显示其介导乳腺癌细胞通过BBB的迁移[12]。星形胶质细胞在脑转移的过程中起到了重要的作用，研究表明其可以通过激活脑转移癌细胞中的PPARγ[13]、促进缝隙连接转运cGAMP从而激活癌细胞的STAT1和NF-κB通路[14]、调节CXCL10-CXCR3轴[15]等促进脑转移的发展。脑部微环境是决定脑转移发展的中心因素，因此，剖析肿瘤细胞跨BBB、阻断脑自然防御及与其他细胞间的相互作用有助更好地理解解脑转移生物学的关键信息。

2.脑转移模型制备策略

研究脑转移的“最佳”模型应该取决于所要聚焦的方向。在肿瘤的异质性或人类特有的基因变化的研究中，因具有重现人类遗传和表观遗传改变以及肿瘤内异质性的优势，以裸鼠为代表的异种移植模型往往是最佳选择，但代价是牺牲宿主中完整的免疫系统[16]。免疫活性人源化受体小鼠用于建立人类来源的异种移植物的最新进展也许是一个具有前景的选择[17]。因此，如果聚焦于癌细胞和免疫细胞的相互作用，那么同基因或免疫活性动物是理想的。如果聚焦于原发肿瘤向转移肿瘤的进展上，那么基因工程小鼠模型（GEMM）是理想的。此外，使用荧光标记细胞并利用生物发光成像进行追踪[18]、以三维微流控系统模拟血脑屏障的关键结构[19]、器官型脑片培养[20]等重要的研究技术目前已成为脑转移研究手段中不可或缺的组合策略。

3.脑转移肿瘤接种方式

理想的脑转移模型可完全概括转移级联，拥有完整的免疫系统，因此原发肿瘤的自发脑转移模型具有很高价值。现实科研实践中，综合研究目的、效率与准确的平衡、药物筛选等的客观需求，如图2所示，目前主流的实验方法是将亲脑细胞系通过注射移植以诱导脑部转移。

图2 脑转移造模接种方式示意图

3.1 脑立体定位注射

Soto等[21]详细介绍了借助于脑立体定位仪进行肿瘤细胞直接脑内植入造模的方法，这种模型涵盖了转移过程的播种和定植阶段，可用于分析中枢神经系统特定区域内的肿瘤增殖和肿瘤-宿主细胞相互作用。Wang等[22]将保留有部分肿瘤基质的人源脑转移组织直接植入裸大鼠脑内，采用MRI、免疫组化、DNA拷贝分析等将异种移植物与患者的肿瘤进行比较。模型脑转移表现出与临床观察相似的放射学特征，原发肿瘤、患者脑转移瘤和异种移植瘤在组织学和生长模式上有显著的相似性，DNA拷贝数分析显示染色体含量的增加和减少有很强的相似性，因此这种脑转移模型可作为评估治疗反应和研究肿瘤中枢神经系统转移背后机制的一个重要工具。

3.2 尾静脉注射

张峻青等[23]使用人肺癌细胞株PC-14反复通过尾静脉注射接种裸鼠以筛选出特异性脑转移肺癌细胞株。一次接种约25%的裸鼠产生脑转移，经4个循环反复接种筛选得到具有脑转移特异性的PC-14/B细胞株，筛选获得的亚株经尾静脉注射可产生4/5的脑转移。杜琴等[24]将肺癌细胞A549与卵巢癌细胞Skov3分别通过尾静脉、腹腔、颈动脉及颅内途径接种（每组16只裸鼠），结果显示尾静脉注射、腹腔注射和颈动脉注射途径Skov3细胞组未发现脑内成瘤，A549细胞组前两种方式各发生2例，后者发生8例颅内成瘤，认为血脑屏障可能在阻止卵巢癌脑转移过程中起了重要作用。因此，尾静脉注射方式在筛选高特异性脑转移肿瘤细胞株、研究某些肿瘤相对较少发生脑转移的机制中有其特殊的意义。

3.3 左心室注射

Conley[25]详细介绍了左心室注射的操作技术：麻醉后仰卧位固定小鼠，前胸壁消毒后在上胸廓做中线切口，露出锁骨和上肋骨，确定第二肋间隙，将注射针插入约4mm，从胸骨左侧2mm开始与胸壁呈45°角将针头插入左心室，缓慢注射总体积约200μl（1×105个细胞）的肿瘤细胞悬液，注射完毕退针封闭切口。

陈愉生等[26]对比经胸腔原位种植与经左心室注射建立肺癌脑转移动物模型，结果显示使用人肺腺癌PC-9细胞通过两种方式造模，前者脑转移率为11.1%，后者脑转移率为100%，说明左心室注射法保证了更高的脑转移率。

Bos等[27]使用ER-的人源乳腺癌细胞CN34与具有肺、骨转移倾向的ER-的乳腺癌细胞MDA-MB-231通过左心室注射方法接种于免疫缺陷雌性小鼠，筛选出具有脑转移特异性的亚克隆，对其进行基因表达及功能分析，确定了环氧合酶COX2、表皮生长因子配体HBEGF、α2，6-唾液酸转移酶ST6GALNAC5是作为癌细胞通过血脑屏障的关键介质。

左心室注射方式大多数小鼠耐受手术且显著降低个体动物的总肿瘤负担，接种的细胞避免了肺毛细血管床的阻滞直接进入体循环，通过动脉系统向脑部转移，到达脑部后进行粘附、增殖、迁移等一系列生物学行为，提高了肿瘤细胞的转移率亦很好的部分模拟了血行播散过程。

3.4 颈动脉注射

Zhang等[28]介绍了颈动脉注射的具体操作步骤：仰卧位固定小鼠，吸入麻醉后颈部消毒，行颈部正中切口约1cm，向下钝性分离暴露颈总动脉，在颈总动脉近心端结扎阻断血流，远心端打松结备用，使用31G针头注射器在解剖显微镜下在两结之间进针并缓慢注射肿瘤细胞悬液（总体积100μl，含1-5×105个细胞），注射完毕后系紧远心端结并关闭切口。

徐磊等[29]使用GFP标记的Lewis肺癌细胞3LL经颈动脉注射方式建立C57BL/6X小鼠脑转移模型，造模动物手术存活率93.75%，手术成功的小鼠术后发生脑转移率100%。魏水剑等[30]使用非小细胞肺癌PC-9细胞通过颈内动脉注射方式建立裸鼠脑转移模型并用MRI成像仪经行活体检测，建模成功率为71%，证明该注射技术是一种经济高效的脑转移造模方式。此外，颈动脉注射还可以将药物、病毒颗粒等其他外源性物质向中枢神经系统高效输送，用作评价药物治疗效果、研究病原体感染脑部病理机制的手段[31]。

4.结语

脑部微环境作为目前研究的热点，其独特的细胞类型、解剖结构、代谢特点、免疫环境与颅外病变微环境截然不同，对肿瘤细胞所施加的选择性压力密切影响肿瘤的转移过程和治疗反应，这凸显了开发包含完整的转移级联和/或脑部微环境的实验模型的重要性。本文概述了脑转移的相关机制及主要的动物模型制备方法，其中立体定向注射可以实现肿瘤细胞在脑实质内生长的检测，心内注射和颈动脉注射可以模拟癌细胞向血液中的扩散，并可用于研究通过血脑屏障的外渗以及在脑内的定植和生长。现有的临床前模型各有侧重的部分揭示了脑转移这一复杂的转移级联过程，未来对脑部具有趋向性的细胞系的扩充建立、造模方式的优化、活体检测技术的完善以及生物信息学的进展将有助于人们更好的认识脑转移生物学的关键信息从而更有效地针对关键靶点进行干预治疗。