椰子果腐病菌的鉴定及生物学特性

温碧柔，林来凤，赖文娜，陈仕林，刘 活，易润华

（广东海洋大学滨海农业学院，广东 湛江 524088）

【研究意义】椰子（Cocos nucifera）为棕榈科（Palmae）椰子属（Cocos）多年生热带木本油料和食品能源作物。椰子原产于亚洲东南部、印度尼西亚至太平洋群岛，主要分布于亚洲、非洲、拉丁美洲等赤道滨海地区，主产国有中国、印度尼西亚、斯里兰卡、印度、菲律宾、泰国和马来西亚等国家。我国种植椰子有2000 多年历史，在我国海南、台湾、广东、福建、广西、云南南部均有栽培。椰树高大挺拔美观，在热带亚热带地区可作为园林绿化树种；椰果经济价值高，可加工为形色多样的产品［1］；椰汁富含蛋白质、果糖、维生素等营养物质，营养价值高；椰肉可加工膳食食品［2］，具有很大的开发潜力。2018 年我国椰子主产区海南省的种植面积3.36 万hm2，总产值达3.86 亿元，总产量2.26 亿个，而2011 年的总产值曾达4.79 亿元［3］。因此，椰子种植可增加农民就业机会和经济收入，促使农民脱贫致富，实现乡村振兴，促进热带现代农业发展。【前人研究进展】据文献报道，约600 多种真菌侵染椰子树根部、叶片、茎干和椰果，引起各种病害［4］。椰果腐病是椰子种植中常见的病害，由多种腐霉如棕榈疫霉Phytophthora palmivora、桂氏疫霉P.katsurae、P.castaneae和P.heveae等引起，在树上引起椰果褐色腐烂，播种发芽时引起芽腐烂。在苗期主要发生叶部病害，主要有灰斑病（棕榈拟盘多毛孢菌Pestalotiopsis palmarum）［5］和炭疽病（Colletrotrichum gloeosporioides）［6］等病害侵染。茎泄血病（stem bleeding）又称茎干腐烂病（stem rot），在椰子种植区均有发生，是一种世界性的病害，对椰子产业发展影响极大。该病害的病原菌为奇异根串珠霉菌Thielaviopsis paradoxa，有性型为Ceratocystis paradoxa，可侵染椰树茎秆，形成黑色病斑，受侵染部位溢出红棕色液汁，导致茎干腐烂［7-8］。在我国椰子主要发生的病害有茎泄血病、果腐病和叶部病害。近年来，报道的椰子病害主要有椰苗叶斑病（Bipolaris setariae［9］、Colletrotrichum gloeosporioides［6］和Curvulariaoryzae［10］）、椰果蒂腐病（Lasiodiplodia theobromae［11］和Pestalotiopsis adusta［12］）、叶枯病（P.menezesiana）［13］等。【本研究切入点】椰果采收后发生的病害主要有椰果底腐病［14］和黑腐病［15］，2017 年12 月，在广东省湛江地区的椰子交易市场发现一种引起椰子果实外果皮黑色腐烂的病害。该病害引起约15%～20% 的果实腐烂。病害发生后传播速度极快，严重时侵染内果皮，导致椰肉腐烂和椰汁变质，经济价值受损严重。【拟解决的关键问题】为确定椰子腐烂的病原菌，本试验对从腐烂果中分离到的纯培养物进行致病性测定，根据分离物形态学特征和ITS 序列分析确定其分类地位，并研究其生物学特性，以期为该病害的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离

用稀释分离法分离病原菌。从发病的椰果上挑取孢子进行梯度稀释制成菌悬液，用混菌法接种到PDA 培养基，置于25 ℃恒温箱中培养3 d，待菌落长出，挑取单菌落，保存备用。

1.2 致病性及寄主范围测定

1.2.1 致病性测定 纯培养物接种到PDA 培养基25 ℃黑暗培养3 d。选取健康的椰子经75%酒精表面消毒后，接种直径为6 mm的菌饼，室温（25～28℃）保湿，观察病害发生情况。试验设3 次重复，以接种6 mm 不带菌的培养基作为对照。

1.2.2 寄主范围测定 接种方法同致病性测定，13种供试寄主植物分别为香蕉Musa nana、芒果Mangifera indica、菠萝Ananas comosus、甘蔗Saccharum officinarum、豆薯Pachyrhizus erosus、木薯Manihot esculenta、菠萝蜜Artocarpusheterophyllus、龙血树Dracaena angustifolia、番木瓜Carica papaya、番薯Ipomoea batatas、白萝卜Raphanus sativus、木兰Magnolia lilifl ora和富贵竹Dracaena sanderiana。香蕉、芒果、菠萝和菠萝蜜的接种部位为果实，白萝卜、番薯和豆薯的接种部位为块根，龙血树、木兰、富贵竹和番木瓜的接种部位为叶片，木薯和甘蔗的接种部位为茎杆。

1.3 病原菌鉴定

1.3.1 形态特征鉴定 参照De Beer 等［16］方法，将病原菌接种到PDA 培养基，25 ℃黑暗培养3 d，观察菌落形态、产孢结构、孢子形态特征。

1.3.2 ITS 序列分析 按照童依婷等［17］的方法PCR 扩增病原菌ITS 序列。扩增引物为ITS1（TCC GTA GGT GAA CCT GCG G）和ITS4（TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC）。PCR 反应体系采用TaKaRa 公司的MightyAmp DNA Polymerase Ver.2试剂盒，扩增体积为50 μL，含1×MightyAmp Buffer、0.2 μmol/L 上下游引物，1.25 U MightyAmp DNA 聚合酶。扩增程序：98 ℃预变性2 min，98 ℃变性10 s，56 ℃退火15 s，68 ℃延伸 1 min，35 个循环。PCR 产物由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。所得序列在GenBank 进行BLAST 比对和同源性分析，用MEGA6.0 软件构建系统发育树，用Bootstrap 进行自举检验，1000 次重复。

1.4 生物学特性测定

测定温度、光照、pH、碳源、氮源和培养基对菌丝生长、产孢量和孢子萌发的影响。用十字交叉法测量菌落直径，显微直接计数测定病原菌的产孢量。将孢子悬浮液涂布在带有厚度约为2 mm PDA 培养基的玻片，保湿培养6 h 后，记录孢子萌发量，计算孢子萌发率。每个处理3次重复。

1.4.1 温度 将病原菌接种到PDA 后分别置于5、10、15、20、25、30、35 ℃黑暗培养3 d。

1.4.2 光照 将病原菌分别接种到PDA 培养基后分别置于24 h 光照、12 h光照12 h黑暗、24 h黑暗、10 min 紫外线+24 h 光照、10 min 紫外线+24 h 黑暗条件下，室温（25～28℃）培养3 d。

1.4.3 pH 将病原菌分别接种至pH 为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 的PDA培养基后置于25 ℃黑暗培养3 d。

1.4.4 碳源和氮源 分别用等质量的葡萄糖、半乳糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖、棉子糖、淀粉和阿拉伯树胶，替换察氏培养基中的蔗糖，以不加碳源为对照；用硫酸铵、硝酸钠、明胶、水解乳蛋白、甘氨酸、尿素、牛肉膏、酵母粉代替察氏培养基中的NaNO3，以不加氮源为对照，病原菌接种后置于25 ℃黑暗培养3 d。

1.4.5 培养基 测试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA：土豆200.0 g、琼脂20.0 g、葡萄糖20.0 g、水1 L）、马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA：土豆200.0 g、琼脂20.0 g、蔗糖20.0 g、水1 L）、燕麦培养基（OMA：燕麦片30.0 g、琼脂17.0 g、水1 L）、椰子叶培养基（MCL：椰子叶30.0 g、琼脂20.0 g、水1 L）、胡萝卜培养基（CM：胡萝卜100.0 g、琼脂18 g、水1 L）、玉米粉培养基（CMM：玉米粉17.0 g、琼脂15.0 g、水1 L）、葡萄糖蛋白胨酵母培养基（GTYA：蛋白胨2.0g、酵母粉1.0 g、葡萄糖10.0 g、琼脂20.0 g、水1 L）。

1.5 室内毒力测定

6 种供试药剂：250 g/L 戊唑醇乳油、400 g/L氟硅唑乳油、300 g/L苯甲·丙环唑（150 g/L丙环唑、150 g/L 苯醚甲环唑）乳油、30%苯甲·吡唑酯（20%苯醚甲环唑、10%吡唑醚菌酯）乳油、60%唑醚·代森联（55%代森联、5%吡唑醚菌酯）水分散粒剂、40%氟硅唑·吡唑乳。试验方法参照杨世杰等［18］和谷会等［19］的方法。

应用SPSS 21.0 软件对试验数据进行ANOVA及DUNCAN 氏新复极差法分析，并用 MEGA 6 软件进行图表分析。用Excel 数据处理系统进行杀菌剂毒力测定的生物统计分析。

2 结果与分析

2.1 致病性及寄主范围测定

2.1.1 致病性 自然发病的椰子果实内部棕黑色腐烂，表面长出白色菌丝，并逐渐变成灰黑色（图1A），形成黑色粉层，果实腐烂。将从具典型症状病组织分离到的菌株YZS 接种到健康无病的椰子，10 d 后，果柄断裂，断裂处有白色菌丝，内部果肉呈黑褐色（图1B），随后整个果实呈棕褐色腐烂。病果上菌丝生长茂盛，菌丝初期白色，后期全部变为灰黑色（图1C），散发出香味。人工接种健康椰子腐烂的症状与自然发病症状一致，对照不发病。从人工接种发病组织中重新分离的纯培养物性状与菌株YZS 相同，证明菌株YZS 为椰子果腐病的病原菌。

2.1.2 寄主范围 用菌株YZS 接种13 种植物，其中菠萝蜜、甘蔗、木薯、香蕉、豆薯、龙血树、芒果和菠萝8 种植物在接种部位形成病斑，引起发病。

图1 椰子果腐病症状Fig.1 Symptoms of fruit rot on Cocos nucifera

2.2 病原菌鉴定

2.2.1 形态特征 在PDA平板上，病原菌生长迅速，25 ℃恒温培养菌落直径 73.7（±0.5）mm，3 d后长满9.00 cm的培养皿，菌落初期白色，后变黑（图2A、B），散发出果香味。气生菌丝棉絮状，菌丝无色，有分隔，分生孢子有大、小两型。大型分生孢子串生于菌丝顶端的孢子梗上（图2C、D），链状排列（图2E、F），单胞，椭圆形，壁较厚，初为无色透明至棕黄色，老熟时为黑褐色，大小为17.3～25.6 μm×9.3～14.6 μm〔平均为20.9（±2.0）μm×11.9（±1.1）μm〕（图2G）。小型分生孢子内生于瓶梗状产孢细胞中，孢子排列成串，成熟后自梗末端的孔口依次释放（图2 H～J），孢子圆柱形，薄壁，无色，平滑，老熟时为棕褐色，大小为6.9～11.7 μm×3.3～4.9 μm〔平均为9.3（±1.0）μm×4.2（±0.4）μm〕（图2K）。

2.2.2 ITS 序列分析 椰子果腐病菌的ITS 序列长约为520 bp，经BLAST 分析，与Thielaviopsis ethacetica（KU377506）、T.paradoxa（MG062870）、T.musarum（JX5183250）、Ceratocystis paradoxa（KJ881375）的同源性为100%。利用MEGA6.0软件构建系统发育树，显示椰子果腐病原菌与它们处于同一分支的自举值为100%（图3）。根据形态学特征（差异分析见表1）及系统发育关系，将椰子果腐病原菌鉴定为Thielaviopsis paradoxa［20-21］。

图2 椰子果腐病病原菌形态Fig.2 Morphology of Thielaviopsis paradoxa

2.3 生物学特性

2.3.1 温度 温度对病原菌菌丝生长、产孢和孢子萌发影响差异显著。在PDA 培养基上，椰子果腐病菌的生长温度为5～35 ℃；在5、10、35 ℃菌丝生长直径和产孢量为0，5、10 ℃孢子萌发率低，而35℃孢子萌发率为47.08%。在15～30 ℃病原菌可生长、产孢和孢子萌发，25、30 ℃菌落直径为88.0 mm，25 ℃时产孢量最大，达190.00×106个/皿；在5～35 ℃孢子均能萌发，25 ℃孢子萌发率最高达49.76%（表2）。

2.3.2 光照 光照对病原菌菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响有显著差异（表3）。24 h 光照条件下菌落生长最快、孢子萌发率最高，菌落直径和萌发率分别为88.0 mm 和70.28%，光照有利于菌丝生长和孢子萌发；24 h 黑暗培养病原菌产孢量最大，产孢量最大，达13.50×106个/皿；紫外线对病原菌菌丝生长、产孢和孢子萌发均有显著的抑制作用。24 h 黑暗或24 h 光照培养时，增加10 minUV 照射，可显著减小菌落直径，降低产孢量和孢子萌发率（表3）。

图3 基于椰子果腐病菌ITS 序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of based on the ITS sequences of Thielaviopsis paradoxa

表1 椰子果腐病菌与其近源种形态特征比较Table 1 Morphological comparison of Thielaviopsis paradoxa with the relative Thielaviopsis spp.

表2 温度对椰子果腐病菌菌丝生长、产孢以及孢子萌发的影响Table 2 Effect of temperature on the mycelial growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa

2.3.3 pH 由表4 可知，病原菌在pH 2～10 范围内均可生长和产孢，pH 6 时菌落直径和产孢量最大，分别为79.8 mm 和10.42×107个/皿，最适合菌丝生长和产孢。孢子在pH 2～11 均能萌发，pH 5 时萌发率最高，达32.07%，pH 2 时萌发率最低，仅为0.13%。

2.3.4 碳源对菌丝生长、产孢以及孢子萌发的影响 由表5 可知，病原菌可利用不同碳源物质进行生长繁殖、产孢和孢子萌发。碳源对病原菌菌丝生长和孢子萌发影响差异显著，除阿拉伯树胶，其余碳源对病原菌产孢影响差异不显著。以阿拉伯树胶作物碳源物质，菌丝生长速度之快，产孢量最大，培养3 d 后菌落直径达88.0 mm，产孢量达18.33×105个/皿。以淀粉为碳源时有利于孢子萌发，萌发率最高为5.03%。

2.3.5 氮源对菌丝生长、产孢以及孢子萌发的影响 氮源对病原菌生长、产孢和孢子萌发影响差异显著。以酵母粉为氮源时病原菌的菌丝生长最快，菌落直径达63.7 mm；最容易产孢，产孢量为52.09×106个/皿；孢子萌发率最高。硝酸钠、硫酸铵、水解乳蛋白、明胶、甘氨酸和尿素对孢子形成影响差异不显著，产孢量明显低于牛肉膏和酵母粉（表6）。

2.3.6 培养基对菌丝生长、产孢以及孢子萌发的影响 病原菌在测试的7 种培养基上都能生长、产孢和孢子萌发。在PDA、PSA 和GTYA 培养基上菌丝生长差异不显著，但在PDA 培养基中生长最快，菌落直径达74.7 mm；在PSA 培养基上产孢量最大，达12.56×107个/皿，在OMA、MCL、CM 和CMM 培养基上产孢结差异不显著；OMA 最适合病原菌孢子萌发，萌发率达41.46%，MCL 萌发率最低，仅为0.07%（表7）。

2.6 6 种杀菌剂对病原菌的影响

对250 g/L 戊唑醇乳油、400 g/L 氟硅唑乳油、300 g/L 苯甲·丙环唑乳油、30%苯甲·吡唑酯乳油、60%唑醚·代森联水分散粒剂、40%氟硅唑·吡唑乳6 种杀菌剂进行室内毒力测定，结果表明，6 种杀菌剂均对病原菌菌丝生长有抑制作用，其EC50分别为0.499、0.020、0.024、0.045、27.200、0.005 mg/L。氟硅唑·吡唑抑制菌丝生长效果最好，氟硅唑和苯甲·丙环唑次之。

表3 光照对椰子果腐病菌菌丝生长、产孢以及孢子萌发的影响Table 3 Effects of light treatments on mycelia growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa

表4 pH 对椰子果腐病菌菌丝生长、产孢以及孢子萌发的影响Table 4 Effect of pH on the mycelia growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa

表5 碳源对椰子果腐病菌菌丝生长、产孢以及孢子萌发的影响Table 5 Effects of carbon sources on the mycelia growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa

表6 氮源对椰子果腐病菌菌丝生长、产孢以及孢子萌发的影响Table 6 Effects of nitrogen sources on the mycelial growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa

表7 培养基对椰子果腐病菌菌丝生长、产孢以及孢子萌发的影响Table 7 Effects of media on the mycelial growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa

250g/L 戊唑醇乳油、400 g/L 氟硅唑乳油、300 g/L 苯甲·丙环唑乳油、30%苯甲·吡唑酯乳油、40%氟硅唑·吡唑乳5 种杀菌剂对病原菌孢子萌发有抑制作用，EC50分别为9.411、38.340、11.777、8.864、3.657 mg/L，氟硅唑·吡唑抑制孢子萌发效果最好，苯甲·吡唑酯次之。

3 讨论

奇异根串珠霉菌（T.paradoxa）是一个从受伤寄主组织侵入的土传植物病原真菌，寄主范围广，可侵染30 多种寄主，对重要的经济作物如菠萝、甘蔗和椰子等造成很大损失［4］。在华南地区可侵染椰子、菠萝、香龙血树、甘蔗、棕榈等植物引起病害［8,23-26］，本研究致病性侵染结果表明该病原物还可以侵染香蕉、芒果、豆薯、菠萝蜜和木薯等多种作物。该病菌可引起菠萝黑腐病、香蕉冠腐病和椰果内部腐烂等病害［27］，是重要的采后病害病原菌。

椰子果腐病菌（T.paradoxa）在25～30 ℃生长速度快、产孢量大和孢子萌发率高，具有较好的耐热性，病原菌在弱酸条件（pH=6）下菌丝生长速度最快和产孢量最大，与谷会等［19］和余凤玉等［8］研究结果一致。病原菌生长速度快、产孢量大、孢子萌发率高和耐热性好等特性意味着病原菌具有较好适应环境变化的能力，加大了椰子果腐病病害的防控难度。紫外线对该病原菌菌丝生长、产孢和孢子萌发有抑制作用，光照对病原菌菌丝生长、孢子产生和孢子萌发有促进作用，这与谷会等［19］报道的结果不同。奇异根串珠霉菌生物学特性研究结果不同反映该病原菌在自然界中存在一定的遗传多样性，是否存在致病性分化，还需要进一步研究。

椰果采收后易受病原菌的侵染，选用合适的药剂进行防腐保鲜是非常必要的。本试验的氟硅唑·吡唑对椰子果腐病菌菌丝生长和孢子萌发的EC50值分别为0.005 mg/L 和3.657 mg/L，苯甲·吡唑酯则分别为0.045 mg/L 和8.864 mg/L，两种杀菌剂均有较明显的抑菌效果。谷会等测定咪鲜胺和苯醚甲环唑杀菌剂对奇异根串珠霉菌丝生长有很好的抑菌效果［19］，其EC50分别为0.0111、0.0126 mg/L。这些杀菌剂对椰子果腐病菌抑菌都有很好的抑制作用，可用于椰子贮藏期的病害防控。

4 结论

通过致病性测定、形态学特征和系统发育分析，确定椰子果腐病的病原菌为奇异根串珠霉菌（Thielaviopsis paradoxa），病原物通过人工接种还可以侵染龙血树、香蕉、芒果、豆薯、菠萝蜜和木薯等植物。

环境因子影响病原菌的生长。在25～30 ℃菌丝生长速度快，产孢量大，孢子萌发率高；光暗交替和紫外线可抑制病原菌菌丝生长、孢子产生和萌发；弱酸环境（pH=6）有利于菌丝生长和孢子形成，而酸性环境（pH=4、5）更适合孢子萌发。

氟硅唑·吡唑和苯甲·吡唑酯对病原菌菌丝生长和孢子萌发均有很好的抑制作用，可用于该病害的化学防治。