巨噬细胞诱导的C 型凝集素在人外周血细胞中的表达及其临床意义

李淑萍，陈韵，崔天娇，王晓华，李金红，郑智华

中山大学附属第七医院肾内科，广东深圳518107

巨噬细胞诱导的C 型凝集素（macrophage inducible C-type lectin，Mincle）是一种Ⅱ型跨膜的 C 型凝集素受体，在天然免疫中起重要作用［1］。Mincle可通过胞外的碳水化合物识别结构域（carbohydrate recognition domain，CRD）和胆固醇-蛋白质结合位点识别自身受损细胞及外源微生物产生的脂类和糖脂类，并介导下游信号通路促进细胞释放炎症因子［2］。由于Mincle 在识别索状因子等含有海藻糖基的脂类和胆固醇过程中起关键作用，其在对抗相关微生物感染的机理和自身免疫疾病中的作用研究已成为研究热点。

Mincle 主要表达于巨噬细胞中，也表达于中性粒细胞、树突状细胞和部分B 细胞等免疫细胞中［3-5］。与配体结合后，Mincle 可通过FcRγ 的免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）向胞内传递激活信号［6］，使Syk 和 Card9-Bcl10-MALT1 等信号通路蛋白活化［7］，最终激活 NF-κB，使细胞分泌 TNF、IL-6、G-CSF、IL-11等炎症细胞因子和CXCL1、CXCL2 等趋化因子来介导对抗微生物感染的炎症反应［1］。由于不同类型的外周血细胞在免疫方面的功能不同，其Mincle 的表达量也可能有所差异，本研究分析了Mincle 在不同类型外周血细胞中的表达量，为探讨其在这些细胞介导的天然免疫功能中的作用机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 人外周血细胞样本 选取15 名体检就诊的人外周抗凝血1 mL。

1.2 主要试剂及仪器 APC 标记的抗人CD11b 抗体购自美国BD Biosciences 公司；Alexa 488 标记的抗人Mincle 抗体购自美国Santa Cruz 公司；Alexa 488标记的抗IgG Isotype Control 兔单抗购自美国Cell SignalingTechnology 公司；胎牛血清（FBS）购自 Thermo Scientific 公司（原产地澳大利亚）；流式细胞仪Cyto Flex XL 购自美国Beckman Coulter 公司，为中山大学附属第七医院科研中心公共设备。

1.3 外周血细胞的处理 取抗凝管中全血1 mL 于15 mL 离心管中，加入 9 mL 红细胞裂解液（0.16 mol／L NH4Cl，10 mmol ／L KHCO3，0.5 mmol ／ L EDTA），4 ℃放置 5 min，300 × g 离心 5 min，弃上清，重复 3 次，最后用含3% FBS 的PBS 重悬细胞。

1.4 Mincle 在不同类型外周血细胞中表达的检测 采用流式细胞术。按照产品说明，在重悬的细胞中加入适量抗人CD11b-APC 抗体和抗人Mincle-Alexa 488抗体，4 ℃避光孵育 1 h；用 1 mL 含 3%FBS 的 PBS 洗涤3 次后，上流式细胞仪检测。使用FlowJo 10 软件（FLOWJO，LLC）对流式细胞结果进行分析并做图。将Alexa 488 标记的同型对照抗人兔单抗和抗人Alexa488-CLEC4E（Mincle）抗体分别染色同一细胞，染色的同一细胞的MFI 减去荧光色素标记细胞的MFI，以确定 MFI 的特异性增加（△MFI）。

1.5 统计学分析 应用SPSS 25 软件进行Mincle 表达量和临床指标的相关性分析，采用双变量线性相关性分析方法，通过斯皮尔曼等级相关系数（Spearman’r）评价两个统计变量的相关性。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Mincle 在CD11b 阳性和阴性细胞中的表达 通过前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）设门选择白细胞群，再进一步通过CD11b-APC 荧光信号强度设门选择CD11b 阳性和阴性的白细胞群进行分析，发现Mincle 表达于CD11b 阳性的髓系白细胞中，但不表达于CD11b 阴性的白细胞中，见图1。

2.2 Mincle 在单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中的表达 通过CD11b-APC 和SSC 将外周血白细胞分为单核细胞、淋巴细胞和粒细胞3 个细胞群，发现Mincle在单核细胞中表达最高，在粒细胞中其次，在淋巴细胞中无表达，见图2。进一步比较来自15 人3 个细胞群的Mincle 表达量，得到相同的结果，且两两比较差异有统计学意义（P ＜0.000 1），见图3。

2.3 Mince 在粒细胞、淋巴细胞和单核细胞中表达量的临床相关性 将Mincle 在粒细胞、淋巴细胞和单核细胞中的表达量分别与部分临床数据进行相关性分析，发现Mincle 在单核细胞中的表达量与红细胞沉降率呈负相关，相关系数为-0.709（P = 0.032）。见表1。

图1 流式细胞术分析人外周血中Mincle 在CD11b 阳性和阴性细胞群中的表达Fig.1 Flow cytometry of expression of Mincle in CD11b-positive and -negative cells in human peripheral blood

表1 部分临床数据与Mincle 在粒细胞、淋巴细胞和单核细胞中表达量的相关性Tab.1 Correlation of partial clinical data to expression levels of Mincle in granulocytes，lymphocytes and moncytes

图2 流式细胞术分析Mincle 在单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中的表达Fig.2 Flow cytometry of expression of Mincle in monocytes，granulocytes and lymphocytes

图3 Mincle 在3 个细胞群中的表达Fig.3 Expression of Mincle in three cell groups

3 讨 论

本研究探究了Mincle 在各类人外周血细胞中的表达分布，结果发现，Mincle 表达于CD11b 阳性的髓系细胞中，其中单核细胞中的表达量高于粒细胞，在淋巴细胞中则无表达。

Mincle 是凝集素受体家族的一员，其家族成员可识别广泛的各类自身和外源配体［8］，其中Mincle的独特作用是识别脂类和糖脂类，还包括SAP130等自身抗原，因此，Mincle 在对抗外源微生物感染和自身免疫疾病中均起着重要作用［2］。外周血中的单核细胞和粒细胞为人体天然免疫的组成部分，是人体对抗外源微生物的防御屏障［9-10］，Mincle 在这两类细胞中高表达，表明其为它们介导的天然免疫过程中的重要参与者。Mincle 在单核细胞中的表达量高于粒细胞，这可能与其在巨噬细胞中的重要作用相关。巨噬细胞由外周血中的单核细胞迁移进入组织分化形成，Mincle 与配体结合后，可促使巨噬细胞释放大量炎症因子来对抗微生物感染［3］。Mincle在单核细胞中的高表达很可能表明其在单核细胞中也有相似的功能。有研究发现［11］，Mincle 在部分B细胞亚群中表达，而本研究并未发现Mincle 在淋巴细胞中表达，这可能与该类B 细胞亚群的数量和激活状态有关。相关性分析发现，在正常人外周血单核细胞中，Mincle 的表达与红细胞沉降率呈负相关，结合红细胞沉降率的临床意义和受试者的平均红细胞沉降率水平，推测正常人群中外周血单核细胞的Mincle 表达量升高可能与正常人群中体内的低水平炎症反应相关。最新关于Mincle 在炎症方面的研究仍集中于感染免疫［12-13］，这也与Mincle 分子本身的定义和来源相符，但其在非感染性炎症和无菌性炎症领域的具体作用机制还有待商榷，需进一步的研究来验证。

综上所述，本研究分析了Mincle 在外周血细胞中的分布，为探讨其在各类细胞所介导的免疫反应和炎症反应中的作用机理奠定了基础。