山羊化脓隐秘杆菌溶血素抗体间接ELISA检测方法的建立、验证及应用

徐登峰 ，张素辉 ，余远迪 ，许国洋 ，赵扬扬 ，付利芝 ，沈克飞

1.重庆市畜牧科学院，重庆402460；2.重庆市兽用生物制品工程技术研究中心，重庆402460

近年，三峡库区山羊体表和脏器发生脓肿现象较为普遍，一定程度上影响了该地区的养羊经济效益。山羊体表和脏器脓肿一般由多种化脓菌混合感染引起，其中对山羊危害严重的是化脓性肺炎等感染，该病在国内多地流行，化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes）是其病原菌之一［1-4］。化脓隐秘杆菌是一种动物黏膜的共生菌，通常寄生于呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，是牛羊多种动物的一种条件性致病菌，可经皮肤、黏膜破损处入侵而引起体表、组织、器官的脓肿［3-4］。

化脓隐秘杆菌感染导致山羊呼吸道疾病引起的危害正逐渐引起重视，该病常演变成慢性消耗性疾病，且为混合感染，临床诊断困难［5］。早发现是防控化脓隐秘杆菌感染的重要环节，因此简便、准确的诊断方法尤为重要。目前，检测和诊断化脓隐秘杆菌感染的方法主要有病原菌分离培养和核酸检测等［5］，这些方法适用于体表感染和病危被剖检的动物，不适用于还有经济价值的脏器感染动物。间接ELISA 法可用于后者的检测和诊断，但目前尚无针对检测山羊化脓隐秘杆菌抗体的间接ELISA 法。溶血素（pyolysin，PLO）是化脓隐秘杆菌分离株分泌的唯一外毒素，是其一种重要的抗原，可作为血清学诊断用抗原［6-7］。本实验采用E.coli 表达系统表达重组溶血素（recombinant pyolysin，rPLO）的 37 ～ 281 位氨基酸，并建立化脓隐秘杆菌感染的间接ELISA 检测法，以期用于山羊化脓隐秘杆菌感染的快速诊断。

1 材料与方法

1.1 菌株 含pET-28a-plo 的重组菌株E.coli BL21（DE3）由重庆市畜牧科学院兽医兽药研究所保存及提供。

1.2 血清 E.coli、链球菌和伪结核棒状杆菌阳性血清、化脓隐秘杆菌阳性山羊抗血清及化脓隐秘杆菌阴性山羊血清（30 份）由重庆市畜牧科学院兽医兽药研究所保存及提供；15 份化脓隐秘杆菌自然感染的山羊血清（经细菌分离鉴定［1］和 PCR 法［5］确诊）、360 份无明显呼吸道疾病临床症状的山羊血清样本采自重庆地区山羊养殖场，由该研究所保存。

1.3 主要试剂及仪器 IPTG 购自宝日医生物技术（北京）有限公司；Ni-NTA 填料购自美国GE 公司；碱性磷酸酶标记的驴抗山羊IgG 购自美国Abcam公司；BCTP ／ NBT 购自生工生物工程（上海）股份有限公司；HRP 标记的兔抗山羊IgG 购自美国Earthx公司；咪唑购自成都市科隆化学品有限公司；96 孔板购自美国Costar 公司。

1.4 重组蛋白的诱导表达 将含pET-28a-plo 的重组菌株 E.coli BL21（DE3）接种至 LB 培养基中，37 ℃，180 r ／ min 振摇培养至 A600约 0.6 时，加入终浓度0.1 mmol ／ L 的 IPTG，37 ℃诱导表达 3 h，5 000 × g离心10 min，收集菌体。菌体用Tris-HCl（pH 8.0）重悬，冰水浴中超声裂解菌体（超声功率为300 W，工作4 s，间歇5 s，超声裂解15 min）。取1 mL 菌体裂解液，12 000 × g 离心1 min，分别取上清和沉淀，经12% SDS-PAGE 分离蛋白后，转移至NC 膜上，用5%脱脂奶粉封闭2 h；TBST 洗涤3 次，加入山羊化脓隐秘杆菌抗血清（1 ∶100 稀释），37 ℃孵育 1 h；TBST 洗涤3 次，加入碱性磷酸酶标记的驴抗山羊IgG（1 ∶1 500 稀释），37 ℃孵育 1 h；TBST 洗涤 3 次，置 BCTP ／ NBT 中显色。

1.5 重组蛋白的纯化 将诱导表达菌液经12000 × g 离心10 min，裂解（同1.4 项）后收集沉淀，用0.05 mol／L Tris-HCl（0.5 mol ／ L NaCl、0.01 mol ／ L EDTA 和2% Triton X-100，pH 8.0）洗涤 1 次，加入 8 mol ／ L尿素溶解包含体；12 000 × g 离心 10 min，收集上清，经 0.22 μm 滤膜过滤，上样 Ni-NTA 层析柱，用0.02 mol／L Tris-HCl（20 mmol／L 咪唑，0.5 mol／L NaCl，8 mol ／ L 尿素，pH 8.0）洗去杂蛋白，用 0.02 mol ／ L的Tris-HCl（150 mmol ／ L 咪唑，0.5 mol ／ L NaCl，8 mol ／ L 尿素，pH 8.0）洗脱。纯化产物进行 12%SDS-PAGE 分析。

1.6 方法的建立及优化 用纯化的rPLO 包被96孔板，4 ℃包被过夜；2%明胶封闭液于37 ℃封闭2 h；加入待检血清（1 ∶100 稀释），37 ℃反应 30 min；用PBST 洗涤3 次，加入HRP 标记的兔抗山羊IgG，37 ℃反应60 min；四甲基联苯胺显色10 min，用酶标仪测定A450值。采用方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度（3.5、0.7、0.14 和 0.05 μg ／ mL）及最佳二抗稀释度（1 ∶10 000、1 ∶20 000、1 ∶40 000）。每种条件分别检测3 份阳性血清和3 份阴性血清，以阳性血清A450值 ＞1，且阳性血清A450均值与阴性血清A450均值比值（P／N 值）最大的反应条件为最佳。

1.7 临界值的确定 采用优化的间接ELISA 法检测30 份已知化脓隐秘杆菌阴性血清，计算阴性血清 A450的平均值（X）和标准差（SD），根据 X + 3 SD值确定临界值，样本的A450＞X + 3 SD 时判为阳性，A450≤ X + 3 SD 时判为阴性［8］。

1.8 方法的验证

1.8.1 特异性 用优化的间接ELISA 法检测E.coli、链球菌和伪结核棒状杆菌阳性血清，并设山羊化脓隐秘杆菌阳性血清和阴性血清对照，每份样本设3 个重复。

1.8.2 灵敏性 将3 份化脓隐秘杆菌阳性血清进行倍比稀释（1 ∶100 ～ 1 ∶1 600），用优化的间接 ELISA法进行检测，并设山羊化脓隐秘杆菌阴性血清对照。

1.8.3 精密性 以同批表达纯化的rPLO 包被96孔板，检测化脓隐秘杆菌阳性、阴性血清各3 份，每份血清设3 个重复，计算批内变异系数（CV）。以不同批表达纯化的rPLO 分别包被3 批96 孔板，检测阳性、阴性血清各3 份，每份血清做3 个重复，计算批间CV。批内和批间CV 均应＜10%。

1.9 方法的初步应用 分别采用琼脂糖凝胶扩散试验和优化的间接ELISA 法检测15 份化脓隐秘杆菌自然感染的山羊血清，计算两者的符合率。同时采用优化的间接ELISA 法检测360 份临床山羊血清样本，以了解重庆地区山羊化脓隐秘杆菌的基本流行情况。

2 结 果

2.1 表达产物的鉴定 经IPTG 诱导重组菌培养物的裂解液沉淀于相对分子质量约34 000 处可见目的蛋白条带，大小与预期相符，裂解产物上清未见明显条带，见图1；且产物与山羊化脓隐秘杆菌抗血清可发生特异性结合反应，于相对分子质量约34 000处可见特异性结合条带，裂解产物上清未见明显条带，见图2。表明rPLO 以包涵体形式表达。

2.2 纯化产物的鉴定 纯化产物于相对分子质量约34 000 处可见目的蛋白条带，大小与预期相符，纯度达90%，见图3。

2.3 间接ELISA 法的最佳反应条件 抗原包被浓度为 0.14 μg ／mL，二抗稀释度为 1 ∶40 000 时，P ／ N值）最大，见表1。因此确定该条件为间接ELISA 法的最佳反应条件。

2.4 临界值 山羊化脓隐秘杆菌30 份阴性血清A450的 X 为 0.305，SD 为 0.056，X + 3 SD ＝ 0.305 +3 × 0.056 = 0.473，即当样本 A450＞ 0.473 时判为阳性，A450≤0.473 时判为阴性。

图1 表达产物的SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE profile of expressed product

图2 表达产物的Western blot 分析Fig.2 Western blotting of expressed product

图3 纯化产物的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE profile of purified product

2.5 方法的验证

2.5.1 特异性 E.coli、链球菌、伪结核棒状杆菌阳性血清、化脓隐秘杆菌阴、阳性血清A450分别为0.249±0.071、0.222 ± 0.065、0.213 ± 0.019、0.214 ± 0.020和1.273±0.027。除化脓隐秘杆菌阳性血清外，其他A450均＜0.473，判为阴性；化脓隐秘杆菌阴、阳性血清A450均符合阴、阳性判定标准。表明该方法特异性良好。

2.5.2 灵敏性 当化脓隐秘杆菌阳性血清稀释至1 ∶800 时，3 份阳性血清 A450仍高于临界值，检测为阳性，见表2。表明该方法灵敏性良好。

表1 间接ELISA 法抗原包被浓度及二抗稀释度的优化Tab.1 Optimization of concentration of antigen coating and dilution of secondary antibody in indirect ELISA

2.5.3 精密性 化脓隐秘杆菌阳性、阴性血清检测结果的批内CV 均值分别为6.33%和3.73%，批间CV均值分别为5.90%和4.57%，均 ＜10%，见表3 和表4。表明该方法具有良好的精密性。

2.6 方法的初步应用 两种方法检测化脓隐秘杆菌自然感染的15 份山羊血清，阳性检出率均为100%，符合率100%，但琼脂糖扩散试验的检测灵敏度较低，仅有4 份血清在1 ∶2 稀释时可见沉淀线，见图4，其他11 份血清在不稀释的情况下可见沉淀线（图略）。表明优化的间接ELISA 方法可用于临床样品检测。采用优化方法检测360 份山羊血清的阳性率为24.1%（87／360），初步得出重庆地区山羊化脓隐秘杆菌感染率较高。

图4 琼脂糖凝胶扩散试验Fig.4 Agarose gel diffusion test

表2 灵敏性试验结果（A450，±s，n = 3）Tab.2 Result of sensitivity test（A450，±s，n = 3）

表2 灵敏性试验结果（A450，±s，n = 3）Tab.2 Result of sensitivity test（A450，±s，n = 3）

样品样品血清稀释倍数1 ∶100 1 ∶200 1 ∶400 1 ∶800 1 ∶1 600第 1 份 1.485 ± 0.158 1.012 ± 0.117 0.778 ± 0.080 0.517 ± 0.061 0.361 ± 0.038第 2 份 1.770 ± 0.179 1.242 ± 0.137 0.885 ± 0.086 0.647 ± 0.065 0.401 ± 0.047第 3 份 1.196 ± 0.128 0.934 ± 0.117 0.728 ± 0.080 0.485 ± 0.050 0.339 ± 0.044

表3 批内精密性试验结果（A450）Tab.3 Intra-assay of precision（A450）

表4 批内精密性试验结果（A450）Tab.4 Intra-assay of precision（A450）

3 讨 论

PLO 是化脓隐秘杆菌主要的毒力因子之一，其作用机理可能与细菌感染过程获取宿主体内的铁有关［9］。plo 基因存在于不同动物源化脓隐秘杆菌分离株中，且高度保守，因此成为各种化脓隐秘杆菌基因检测方法的首选靶基因［5］。PLO 序列中的前半部分存在B 细胞表位［10］，感染或免疫能刺激机体产生 PLO 特异性抗体［6］。

本研究以纯化的rPLO 作为包被抗原，HRP 标记的兔抗山羊IgG 抗体作为二抗，采用方阵滴定法对ELISA 反应条件进行了优化，确定抗原包被浓度为 0.14 μg ／ mL，二抗稀释度为 1 ∶40 000 时为最佳反应条件。利用已知的化脓隐秘杆菌阴性血清确定了阴阳性临界值，当样本A450＞0.473 时判为阳性，A450≤0.473 时判为阴性。在此基础上，对方法的特异性、灵敏性和精密性进行评估。特异性试验结果显示，优化的间接ELISA 法对E.coli、链球菌和伪结核棒状杆菌阳性血清无交叉反应，具有良好的特异性。灵敏性试验结果显示，该方法能检测到800 倍稀释的阳性血清，灵敏性良好。在批内、批间精密性试验中，CV 均＜10%，表明方法具有良好的精密性。对15 份阳性血清的检测结果显示，间接ELISA 方法和琼脂糖凝胶扩散试验的阳性检出符合率为100%，表明该方法可用于临床样品检测。利用所建立的间接ELISA 方法检测采自重庆地区的无明显呼吸道疾病临床症状的山羊血清样本，阳性率为24.1%，表明化脓隐秘杆菌在重庆山羊中感染率较高，应进行进一步防控。通过Western blot 技术证实，PLO 的抗原关键表位区域是第64 ～79 位氨基酸（即 VPVTKDQLKDGTYTVF）和第 58 ～ 75 位氨基酸（即 GESIENVPVTKDQLKDGT）［11-12］。本研究表达了除信号肽部分的前271 位氨基酸残基的PLO 蛋白，结果显示，rPLO 能被山羊化脓隐秘杆菌免疫的山羊抗血清识别，可用于建立化脓隐秘杆菌血清学检测试剂盒。