SS18阳性滑膜肉瘤中ALK及C-met的表达及其临床意义

陈少华，曾德华，曲利娟，郑智勇，陈一峰，欧阳小娟，王旭洲，许存宝，吴春林

滑膜肉瘤是一种少见的恶性间叶源性肿瘤，患者总体预后不良，尤其是难以根治切除、晚期复发或转移者[1]。间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)及间质表皮转化因子(cellular-mesenchymal to epithelial transition factor, C-met)均属于酪氨酸激酶受体家族成员，其过表达常与肿瘤晚期相关，提示患者预后不良[2-3]。目前，ALK及C-met的研究和临床应用更多局限于恶性上皮性肿瘤，如非小细胞肺癌等[4]，国内外对恶性间叶源性肿瘤的研究少见[5-8]，尤其是滑膜肉瘤。本实验拟通过免疫组化、FISH、RT-PCR检测ALK及C-met在滑膜肉瘤中的表达，探讨其与临床病理特征及预后的相关性，以期为指导临床治疗和预后评估提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集福建医科大学附属第二医院、中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院及福建医科大学附属泉州市第一医院病理科2006年6月～2019年6月经病理确诊的82例滑膜肉瘤，并制成组织微阵列，经SS18 FISH检测共筛选出阳性38例。收集38例SS18阳性滑膜肉瘤的临床病理及随访资料，其中有5例为术后复发，其余术前均未进行任何相关治疗，治疗方案均为肿瘤切除，部分辅以淋巴结清扫。38例患者中失访2例，另36例患者随访时间5～143个月，中位随访时间44个月。本实验获福建医科大学附属第二医院伦理委员会批准，所有患者均知情同意。

1.2 组织微阵列复习82例滑膜肉瘤HE切片，选取代表性区域(图1)，采用Quick-Ray组织微阵列系统，从供体蜡块中抽取典型肿瘤组织2个点，移至预制受体蜡块(2.0 mm直径，6×10位点)相应孔内，以正常肝组织为起始标记点，制成组织微阵列蜡块；行4 μm厚连续切片，制成可供FISH检测及免疫组化染色使用的组织微阵列数张。手动组织微阵列仪Quick-Ray(型号UATM-272)及预制受体蜡块均购自韩国UNITMA公司。

1.3 免疫组化免疫组化染色在Ventana全自动免疫组化染色机中完成，并设置阳性及阴性对照。一抗兔抗人ALK单克隆抗体(D5F3，工作液)购自Ventana Medical Systems公司；鼠抗人ALK单克隆抗体(5A4，工作液)购自福州迈新公司；兔抗人C-met单克隆抗体(SP44，工作液)购自北京中杉金桥公司。

1.4 FISH将相应组织切片经常规脱蜡至水，热水浴，蛋白酶K消化，10%中性福尔马林固定，梯度乙醇脱水，加相应探针混合液(SS18、ALK、C-met)，杂交仪85 ℃变形，42 ℃杂交过夜，NP-40/SSC洗涤，70%乙醇洗片，干燥，加DAPI复染剂，封固。SS18(SYT)基因检测试剂盒购自北京金菩嘉公司。ALK及C-met基因检测试剂盒均购自Abbott Molecular公司。

1.5 RT-PCRALK(D5F3)蛋白高表达者组织5 μm厚切片10张，烤片后按HE切片划定的肿瘤区域，用无菌刀将组织刮入1.5 mL EP管中。RNA提取试剂盒提取RNA后，用人类EML4-ALK融合基因试剂盒在AMx3000P测序仪上检测。具体操作步骤参考试剂盒说明书。RNA提取试剂盒及人类EML4-ALK融合基因试剂盒，均购自厦门艾德生物公司。

1.6 结果判读

1.6.1FISH判读 SS18及ALK易位：计数100个肿瘤细胞，>15%的细胞核显示红绿信号分离，且大于信号宽度2倍以上，判为基因易位，否则为阴性。C-met扩增：计数100个肿瘤细胞中Met和CEP7信号的数量，若Met/CEP7比值≥2.2，则为阳性；若Met/CEP7比值<2.2，但平均Met拷贝数≥5.0，亦为阳性；若Met/CEP7比值<2.2且平均Met拷贝数<5.0，则为阴性。

1.6.2免疫组化评分 ALK定位在细胞质，C-met定位在细胞质/膜。按染色细胞百分率计分：<1%为0分；1%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分；按细胞染色强度计分：无阳性染色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。将两项评分相乘作为最终评分：0分为阴性，1～3分为弱阳性，4～7分为中度阳性，>7分为强阳性；中度阳性及强阳性定义为高表达。所有结果均经2位病理医师独立评估，意见不一致病例在多头显微镜下共同协商确定。

1.6.3RT-PCR判读 EML4-ALK结果判读具体参考人类EML4-ALK融合基因试剂盒说明书。

1.7 统计学方法采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，利用χ2检验和Fisher确切概率法分析ALK(D5F3)及C-met表达与临床病理特征及预后的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 滑膜肉瘤中SS18基因的表达82例滑膜肉瘤的组织微阵列经SS18 FISH检测，共筛出38例SS18信号分离病例(图2)。

2.2 SS18阳性滑膜肉瘤的临床病理特征38例SS18阳性滑膜肉瘤患者年龄8～72岁，平均41岁；发生于四肢23例(60.5%)；躯干15例(39.5%)，其中肺及肾脏各2例，腹膜后1例；原发33例(86.8%)，复发5例(13.2%)。根据FNCLCC分级系统及第8版AJCC分期标准进行组织学分级及TNM分期，其中5例复发肿瘤未进行组织学分级及TNM分期，肺及肾脏共4例无明确TNM分期标准，故组织学分级Ⅰ级0例，Ⅱ级19例(57.6%)，Ⅲ级14例(42.4%)；TNM分期Ⅰ期0例，Ⅱ期14例(48.3%)，Ⅲ期15例(51.7%)。

2.3 SS18阳性滑膜肉瘤中ALK和C-met蛋白表达及与临床病理特征、预后的关系38例SS18阳性滑膜肉瘤中，ALK(D5F3)阳性7例(18.4%)，其中6例弱阳性，1例强阳性(图3)，高表达率为2.6%(1/38)。ALK(5A4)均为阴性(图4)。C-met阳性7例(18.4%)，其中3例弱阳性，3例中度阳性，1例强阳性(图5)，高表达率为10.5%(4/38)。ALK/C-met高表达者4例，其中ALK+/C-met+者1例，ALK-/C-met+者3例(表1)。C-met表达与组织学分型、组织学分级差异有统计学意义(P<0.05，表2)，而在患者性别、年龄、部位、肿瘤直径、核分裂数、临床分期和预后，差异无统计学意义，但高表达者病死率或转移率达75%(3/4)。ALK(D5F3)表达在各临床病理特征上差异均无统计学意义，但唯一高表达者发生肺转移。ALK(D5F3)与C-met两者表达无明显相关性(r=0.124，χ2=0.588，P=0.383)。

2.4 ALK及C-met基因检测唯一ALK(D5F3)蛋白高表达者ALK FISH检测见ALK基因易位(肿瘤细胞约20%)(图6)，但EML4-ALK RT-PCR为阴性。4例C-met蛋白高表达者C-met FISH均为阴性(图7，表1)。

①②③④⑤⑥⑦

3 讨论

近年来，针对ALK/C-met靶点的研究及其靶向药物的临床应用已在众多恶性上皮性肿瘤中取得重大进展，在间变性大细胞淋巴瘤及神经母细胞瘤中也证实有效果，但对恶性间叶源性肿瘤的研究及临床试验仍少见，尤其是滑膜肉瘤。研究显示，ALK及C-met蛋白在横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤及未分化肉瘤中均有一定阳性率，且均有少量ALK及C-met FISH阳性病例存在[5-8]。此外，炎性肌纤维母细胞性肿瘤、腺泡状软组织肉瘤，恶性外周神经鞘膜瘤、尤因肉瘤等也存在ALK蛋白及ALK FISH阳性病例[7,9-12]；而透明细胞肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤等也存在C-met蛋白及C-met FISH阳性病例[6,13]。文献有报道少量ALK/C-met蛋白阳性滑膜肉瘤，但进一步行C-met FISH检测较少，总之ALK易位或C-met扩增滑膜肉瘤病例罕见[6-7]。本实验在较大宗基因确诊滑膜肉瘤病例中对ALK及C-met表达情况进行探讨。

表2 SS18阳性滑膜肉瘤中ALK及C-met表达与临床病理特征及预后的关系[n(%)]

本实验结果显示，C-met在滑膜肉瘤中阳性率为18.4%(7/38)，其表达在组织学分型、组织学分级差异有统计学意义，提示：(1)阳性组中双相型明显多于单相型，并观察到5例双相型阳性病例中上皮成分均有表达，仅1例同时表达少量梭形细胞成分；(2)阳性组中组织学分级Ⅲ级明显居多，而在临床分期及预后差异无统计学意义，但观察到75%(3/4)高表达者出现死亡或转移，提示C-met阳性患者预后欠佳。ALK(D5F3)在滑膜肉瘤中阳性率为18.4%(7/38)，其表达与各临床病理特征差异无统计学意义，且其与C-met表达无明显相关性。本实验还检测ALK(5A4)蛋白，但结果均为阴性，故对滑膜肉瘤ALK蛋白初筛，建议选用克隆号D5F3更为合适。

本组中ALK/C-met蛋白高表达者仅4例，其中ALK+/C-met+者1例，ALK-/C-met+者3例。ALK+/C-met+者免疫表型为ALK(D5F3)弥漫强阳性、C-met多灶中度阳性；ALK FISH阳性提示肿瘤细胞存在ALK基因易位，但EML4-ALK RT-PCR阴性提示ALK基因不与EML4基因发生融合；C-met FISH未见C-met扩增；该患者于术后36个月发生肺转移。3例ALK-/C-met+者C-met FISH均未见C-met扩增。Fleuren等[14]研究显示ALK蛋白在14%(6/43)滑膜肉瘤中表达，6例阳性肿瘤仅1例显示ALK易位，而C-met蛋白阳性率超过50%，但未进一步行C-met FISH检测，且未对该组病例进行相关临床病理分析。本实验ALK阳性率与Fleuren等[14]研究结果基本一致，但C-met蛋白阳性率明显偏低。

文献报道克唑替尼、TAS-115等作为ALK/C-met靶点的双重酪氨酸激酶抑制剂，对体外和体内ALK/C-met依赖的滑膜肉瘤细胞均具有抑制生长作用[14-15]，且以往文献及本实验均显示ALK及C-met在滑膜肉瘤中有一定阳性率，提示ALK/C-met可能是该亚型的潜在治疗靶点，但尚未见ALK/C-met抑制剂针对该亚型治疗的相关临床试验。克唑替尼在炎性肌纤维母细胞性肿瘤患者靶向治疗中有明显疗效[11]，个别晚期上皮样炎性肌纤维母细胞肉瘤患者可获得明显缓解[12]，但其肿瘤组织中均可检测到ALK蛋白表达及基因易位；而对横纹肌肉瘤及透明细胞肉瘤却均未观察到明显临床客观反应，文献报道多数病例可检出ALK/C-met蛋白表达，但未能检测到ALK易位或C-met扩增，或未阐述基因检测情况[13]。因此，作者建议针对ALK/C-met靶点的滑膜肉瘤临床试验适应者筛选，不应仅有ALK/C-met蛋白表达，更应有分子基因检测确认；无蛋白及基因检测结果者，不建议应用该类靶向药物治疗。

综上，对滑膜肉瘤ALK蛋白初筛，选用克隆号D5F3更为合适。滑膜肉瘤中C-met蛋白更常表达于双相型上皮细胞成分及组织学分级高者，ALK/C-met高表达者预后欠佳。ALK及C-met在滑膜肉瘤中有一定阳性率，提示ALK/C-met可能是该亚型的潜在治疗靶点。