细胞内的翻译后易位研究进展

王圣岩

（福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350117）

研究中最早发现的内质网易位方式是依靠信号识别颗粒（signal recognition particle,SRP）的共翻译易位（co-translational translocation）。在共翻译易位中，蛋白先在核糖体上翻译出信号序列，通过信号序列的疏水性与细胞质中的SRP结合，翻译暂停。SRP牵引核糖体蛋白质复合物向内质网转移，并与内质网膜上的SRP受体结合，核糖体结合在Sec61上，翻译继续，最终将蛋白质引导至Sec61通道中[1-4]。在酵母中的研究发现，共翻译易位方式只占了全部分泌蛋白的43.3%；还有56.7%的蛋白运输并不依靠SRP[5]，比如锚定蛋白和比较短的分泌蛋白则需要另一种途径完成转运，即翻译后易位（posttranslational translocation）途径。参与翻译后易位的蛋白其信号序列疏水性不足或长度不够，不能被细胞质中的SRP识别，所以它们需要另一种分子伴侣引导蛋白定位到内质网上。在真核生物中，分泌蛋白向内质网转运是蛋白质分泌初始阶段的关键步骤，如果这个过程出现错误，蛋白质稳定会被破坏甚至导致细胞功能障碍[6]。为了更好地了解翻译后易位，本文对翻译后易位的相关机制进行了综述，同时也描述了Sec复合物的结构和功能。

1 翻译后易位途径

分泌蛋白质是生物体进行生命活动的重要组成部分，而这些蛋白质想要发挥功能就需要进入内质网进行进一步加工。根据进入内质网方式的不同，转运方式分为共翻译易位和翻译后易位。这两种方式的区别主要体现在蛋白质翻译的时机和靶向内质网方式的不同。真核生物中细胞器被膜分隔成独立的区域，蛋白质前体合成后需要进入内质网加工。由于内质网膜的存在，从细胞质进入内质网需要有分泌信号通路（general secreation pathway,Sec）的参与，进而再运输到特定的区域发挥功能，这就需要蛋白质在转运过程中精准靶向[6]。翻译后易位途径可分为三个步骤：第一步是多肽链在细胞质中通过核糖体完成合成，然后细胞质中的分子伴侣结合到多肽链上将其引导至内质网膜上；第二步是多肽链N短的信号序列进入Sec通道，在其它Sec蛋白的帮助下通道扩大，信号序列在通道内切割并从通道侧面释放；第三步是通过内质网内部的分子伴侣将多肽链拉入到内质网里面进行加工折叠[7]（图1）。

图1 翻译后易位途径

2 翻译后易位复合物组成和结构

翻译后易位机制复杂，需要内质网膜上多种复合物及细胞质中和内质网腔内分子伴侣的参与。在翻译后易位过程中，分泌蛋白依然是通过Sec61通道进入内质网，但额外需要Sec62-Sec63复合物的辅助。酵母内质网膜上Sec复合物组成如图1所示，这些复合物相互作用，共同完成翻译后易位过程。翻译后易位复合物在酵母、人和小鼠中名称有所差别（表1）。

表1 参与翻译后易位的Sec复合物

Sec61 复合物是蛋白质转运机制中的关键元件，形成一个内部疏水的蛋白质转运通道[8]。Sec61转运通道由三个亚基构成，分别是Sec61p、Sss1和Sbh1。Sec61p是最主要的亚基，也是最大的亚基，它包含十个跨膜螺旋（transmembrane helices,TM），呈沙漏状，多肽就是通过这个通道转运到内质网内[9]。Sec61p有两个较大的环L6和L8，它们位于细胞质面，是在共翻译易位期间核糖体的结合位点。Sss1和Sbh1体积较小，附着在Sec61p周围并与之产生联系。在闲置状态下，转运通道被一个阀塞结构域堵住，这个结构域由第一个跨膜螺旋（TM1）之后的片段形成，在蛋白质开始易位时这个结构会移开，从而使通道打开[10-12]。这个通道还包含一个侧门（lateral gate），由TM2和TM7构成，可以将多肽释放到脂质相中，并且信号序列被切割之后将从此处被释放[9]，侧门的打开是可溶性分泌蛋白疏水性信号序列的识别和跨膜蛋白整合所必需的。Sec61p开放与关闭状态下的结构已被解析，具体结构特征可参考Voorhees等人的研究工作[10]。

Sec62 由一个球状的N末端、C末端和两个跨膜螺旋（TM1、TM2）组成，N末端和C末端均位于细胞质中，两个跨膜螺旋被内质网腔内一个短的环连接，Sec62整体结构呈现“V”字型[9]。Sec62与Sec61p主要是以Sec62-TM1和Sec61p-TM3、N末端接触。在Sec62-TM2之后存在一个平躺在膜上的椭圆形结构域，称为锚定区域。这个区域富含疏水性，在酿酒酵母中对其中疏水性残基进行单点突变不会导致生长缺陷，但在215-220位中进行三个连续的突变就会致死，说明疏水性的降低会终止其与内质网膜的相互作用，这个锚定区域的功能是将Sec62正确定位在Sec61上[9]。

Sec63 由三个跨膜结构域构成，在细胞质面有一个FN3结构域并且在内质网腔内含有一个J结构域[13]。与Sec63紧密相关的Sec71（也被称为Sec66、Hss1）和Sec72（也被称为Sec67、Sim2）最初是从调节膜蛋白转位缺陷的酵母遗传机制中筛选出来的[14]。Sec71是一种单跨膜蛋白，含有三个α螺旋其中两个在N末端构成Sec71的底部，C末端带有一个胞质结构域。Sec72是一种外周膜蛋白，由一个带有TPR（tetratricopeptide repeat）结构域的C末端和一个于Sec71相互作用的N末端结构与构成[15-17]。这两个亚基通常以Sec71-Sec72复合体出现， Sec71整合到Sec复合物上需要Sec72的存在，而Sec71又对Sec72在体内的稳定性至关重要[15]。Sec71-Sec72复合体仅由各自的一条肽链进行连接，在Sec71中只需要胞质端的结构域就可满足连接的需要[17]。此外，TPR结构域会与细胞质中的分子伴侣Ssa1和Ssb1相互作用，分别将翻译后易位蛋白和共翻译易位蛋白募集到Sec71-Sec72复合物上[17]。

3 翻译后易位的调控机制

参与翻译后易位的蛋白主要是锚定蛋白和分泌蛋白。锚定蛋白带有一个疏水性的跨膜区，跨膜区会引导蛋白向内质网定位[18]。最早被发现的与锚定蛋白翻译后易位相关的细胞质因子是信号识别颗粒，所以有可能存在一种与共翻译途径相关的翻译后SRP依赖性转位途径[6]。分泌蛋白，例如酵母中的PpαF能够有效的证明翻译后易位的存在[19,20]。分泌蛋白的信号序列没有足够的疏水性来与SRP进行有效的结合[21]，所以在转位的过程中需要细胞质中的分子伴侣来促进蛋白的易位，例如酵母中的Hsp (heat shock protein)70、Hsp40等。Hsp70并不是单独发挥功能，而是需要各种辅助因子，例如J-蛋白（Hsp40），J-蛋白会与未折叠的蛋白进行初步结合并将其传递到Hsp70[22]，进而防止蛋白折叠和聚集。Hsp70中有一个Ssa1蛋白与翻译后易位相关，其可以通过C末端与Sec72的TRP结构域相互作用[17]，翻译后易位蛋白便可以通过Ssa1到达内质网膜。

在翻译后易位的初始阶段，多肽N端进入Sec61复合物的易位通道，N端的信号序列必须与信号肽酶结合被切割分离，但翻译后易位信号序列被切割的时机仍不清楚。Sec62有时会在信号序列切割的环节中造成一些影响，比如它会阻止信号序列从易位通道侧门的释放或者阻止信号肽酶对与切割位点的结合，正常情况下Sec62-TM2与Sec61-TM7会改变原来的构象，两者之间产生空隙从而释放被切割的信号序列[9]。同时，Sec62可以形成一道屏障来防止脂质通过打开的通道侧门渗透到易位通道的内部，脂质的渗透可能会通过竞争性抑制多肽进入通道从而影响蛋白质易位[9]。近二十年的一些研究中发现了Sec62在翻译后易位中的作用，但Sec62在蛋白质易位过程中的详细功能仍然是不能完全确定的，Lakkaraju等人发现由不多于100个氨基酸组成和部分由120-160个氨基酸组成的翻译后易位蛋白的前体会依赖Sec62进行有效转运[23]。在Lang等人的一项研究中，Sec62的沉默会导致小的分泌蛋白通过翻译后易位进入内质网的效率降低，但不会影响共翻译易位和锚定蛋白翻译后易位膜插入的能力[24]。

多肽链的进入Sec61通道后，内质网内的分子伴侣，如BiP，可以起到引导作用，保证新生蛋白质通过易位通道单向运输到内质网腔中。为了促进这些分子伴侣与转运中的多肽链之间的相互作用，Sec63的J结构域介导了它们之间的相互作用。有研究证明，Sec63与BiP的相互作用在某些易位蛋白质运输的早期阶段可以有效促进其进入Sec61通道[25,26]，但并不适用于全部蛋白，所以Sec63在转运机制中的特异性还有待研究[14]。

无论是在体内还是体外，Sec62和Sec63的突变对不依赖于SRP的翻译后易位蛋白的转运有影响，而对依赖SRP转运的共翻译易位并无影响，说明了蛋白质的转运方式是由信号序列影响的[13]。在翻译后易位中，Sec62-Sec63复合物与Sec61复合物的相互作用会使得通道侧门的开口更大[27,28]，而共翻译易位中核糖体打开的侧门开口会小的多[28,29]。Sec63位于Sec61通道侧门的对面，与通道侧门的开放程度有关，Sec63敲除之后侧门开口会缩小，虽然Sbh1也处于侧门附近，但它对开口的影响不大[13]。Sec63不仅能打开侧门还可以激活Sec61通道进行易位，最近的一项研究也为真核生物中Sec62和Sec63如何激活Sec61通道进行翻译后蛋白质易位提供了一个比较详细的研究模型[9]。Sec63通过两个部分与Sec61接触：一个是通过Sec61-TM3固定在Sec61复合物上；另一个是通过TM3附近在内质网中的短片段和Sec63N末端与Sec61通道相互作用[9]。Sec63是通过细胞质和内质网中结构域的双重作用下打开Sec61侧门的。Sec62可以激活Sec61通道，但其与处于关闭状态下的侧门的结构是不兼容的，所以在Sec62激活蛋白质易位通道之前必须先由Sec63将侧门打开[9]。

Sec72 与细胞质中的分子伴侣 Ssa1、Ssb1在蛋白质易位中发生作用，无论共翻译易位蛋白还是翻译后易位蛋白都会被募集到Sec71-Sec72复合体上，这改变了之前认为只有共翻译易位才存在靶向过程的认知，说明了热休克蛋白分子不仅仅是让多肽保持未折叠状态，且能够对翻译后易位蛋白进行靶向[30,31]。在翻译后易位中由Hsp70与免疫球蛋白BiP（酵母中称为Kar2）提供多肽链的易位动力，BiP被认为是通过与肽链的结合来催化蛋白质通过Sec61通道，并且能够防止多肽链反向移动到细胞质中[32]。

4 未来与展望

在对翻译后易位的研究中揭示了蛋白质向内质网易位的复杂过程，这个过程需要细胞质因子、内质网膜蛋白和内质网腔内分子伴侣的共同作用。对翻译后易位的研究具有重大意义，尤其是在外源蛋白表达系统中，随着翻译后易位途径的调控机制被揭示，外源蛋白表达系统对分泌蛋白的表达量或许可以高出原来的几倍，这无疑是外源蛋白表达系统的一个巨大潜力。但目前对翻译后易位的分子机理的研究还不够全面，在蛋白质易位的过程中或许还涉及其他尚未发现的成分。Sec复合物对生命体是不可或缺的，但其每一步构象变化的时机和识别机制还有待充分探索。