福尔马林固定石蜡包埋标本二代测序终文库去除引物二聚体的方法

许 洁，张科平，林丹义，陈 洁，朱小兰，骆新兰

二代测序(next generation sequencing, NGS)技术能够同时对上百万乃至数十亿个DNA分子进行测序，相较于传统测序技术，其速度较快、一次可检测大量靶基因，因而广泛应用于染色体非整倍体无创产前筛查、肿瘤靶向治疗基因突变检测、遗传性肿瘤检测、病原微生物及宏基因组检测等领域。影响NGS结果的限制性因素包括：平台类别、靶区域富集方法、文库构建及扩增效率、测序数据量、生物信息学分析流程等。NGS流程主要包括3个部分：文库制备、测序和数据分析，建库是NGS实验第一步，终文库质量的好坏直接影响后续测序仪上机实验及数据分析。目前常用的建库方法有杂交捕获和扩增子建库，无论哪种建库方法都会运用PCR方法，引物二聚体是PCR实验过程中引物的3′端间相互错配扩增形成的，若终文库引物二聚体含量高，占用测序数据量，直接影响测序数据质量。如何有效去除引物二聚体，同时不影响终文库质量，是众多实验者考虑的问题，本实验应用AMPureXP beads对福尔马林固定石蜡包埋标本终文库引物二聚体进行纯化，得到较满意的结果，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂石蜡标本DNA提取试剂盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit(德国，Qiagen，56404)，人多基因突变检测通用试剂盒(燃石医学，RS03F-12)，人多基因突变检测捕获探针-朗克(燃石医学，RS010-12，V3)，人多基因突变检测捕获探针-凯康(燃石医学，RS032-12，V2)，DNA 1000 Reagents(Agilent，5067-1504)，QUBIT dsDNA HS Assay(Life，Q32856)，AMPureXP beads(Beckman，A63882)，人类EGFR基因突变检测试剂盒(厦门艾德生物公司，8.0120201 W012B)，人类KRAS基因突变检测试剂盒(厦门艾德生物公司，8.0120102W006B)；高通量测序仪(美国，Illumina，MiSeqDx)，生物分析仪(美国，Agilent，2100)，核酸定量仪(美国，Life，Qubit 4.0)，荧光定量PCR仪(美国，Roche，LightCycler480)。

1.2 标本来源选取广东省人民医院病理科2019年9～11月存档的41例福尔马林固定石蜡包埋标本，均为手术大标本，其中24例结直肠癌，17例肺癌，男性24例，女性17例，平均年龄(54.83±10.51)岁。

1.3 方法

1.3.1DNA提取 10 μm厚组织切片8张，切片贴于干净的玻片上。二甲苯脱蜡至水后，按照HE染色片所选取的肿瘤区域，小心用无菌刀片将肿瘤组织刮入1.5 mL EP管中。应用石蜡组织DNA抽提试剂盒QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取DNA。

1.3.2NGS建库实验 应用人多基因突变检测通用试剂盒建库，根据不同癌种选择不同探针建库(肺癌选用朗克，结直肠癌选用凯康)。最后得到20 μL终文库，对其进行质控：使用核酸定量仪(美国，Life，Qubit 4.0)对其浓度进行定量，使用生物分析仪(美国，Agilent，2100)对其片段进行评估，此建库方法加接头文库FFPE DNA的片段主要分布在300～500 bp。

1.3.3终文库引物二聚体去除 挑取其中12例引物二聚体峰高度超过主峰1/3高度的终文库，使用AMPureXP beads(Beckman，A63882)对其进行纯化：加入1.8倍终文库体积的XP磁珠，将文库DNA片段与磁珠结合，用70%的乙醇洗2次磁珠(吸附DNA片段)，去除污染物，最后加入初始体积一半的溶解缓冲液(elution buffer， EB)即 10 μL 溶解纯化后的文库，对该纯化后的终文库进行质控：使用核酸定量仪对其浓度进行定量，使用生物分析仪对其片段进行评估。

1.3.4NGS上机 根据MiSeqDx高通量测序仪标准操作流程操作，对下机数据进行质控。

1.3.5运用突变扩增阻滞系统(amplificationrefractorymutationsystem,ARMS)-PCR验证 使用厦门艾德生物公司的EGFR及KRAS突变检测试剂盒对12例终文库使用AMPure XP beads纯化的标本进行验证，ARMS-PCR实验严格按试剂说明书操作。

1.4 统计学分析所有数据应用SPSS 18.0软件进行统计学分析，两组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

12例终文库经过纯化，2100生物分析仪结果显示，均有效去除引物二聚体，且主峰位置、主峰荧光响应值变化不大，差异无统计学意义(P>0.05，表1，图1)，核酸定量仪对其浓度进行定量，均在可实验范围内，差异无统计学意义(χ2=2.420，P=0.120，P>0.05，表1)，上机数据质控通过，使用ARMS-PCR法对EGFR基因和KRAS基因常见突变进行验证，结果相符。

表1 终文库二次纯化前、后浓度及主峰位置、荧光响应值对比，主要质控参数及测序结果

图1 (例9)样本终文库纯化前后生物分析仪2100电泳结果图：A.纯化前；B.纯化后

3 讨论

NGS可以利用少量样本获得多基因、多位点的突变信息，并利用这些突变信息为患者选择合适的靶向治疗，同时发现更多未经报道的新的基因突变类型，为新的靶向药物研发提供依据[1]。通过多基因检测可以实现在病程早期接受特异的针对性治疗，减少毒副作用，提高治疗效果，对临床加快有效筛选目标人群有重要意义[2]。影响NGS实验结果的因素很多，本实验采用国家药品监督管理局(NMPA)批准的建库试剂盒，遵照相关技术规范，使得样本预处理至文库构建、测序、质控的技术标准化，形成一套NGS技术可行性SOP。测序文库的质控是标准化流程的第一步，如果文库质控数据差，应及早终止实验。在常规病理诊断中，肿瘤标本通常以福尔马林固定石蜡包埋形式加以保存，其会引起DNA的片段化以及交联反应[3]。基于石蜡组织本身的特性，在建库过程中难免会形成引物二聚体，影响终文库质量，如何有效去除引物二聚体，保证有效测序数据量的产出是福尔马林固定石蜡包埋样本建库必须考虑的问题之一。作者发现引物二聚体峰一般出现在100 bp以内，采用AMPureXP法可以提取大于100 bp PCR产物，去除小于50 bp的引物，故而本实验选用AMPureXP试剂，根据说明书建议，加入1.8倍终文库体积的XP磁珠，考虑到实验过程中会有损耗，使用初始体积一半量的EB溶解纯化后的文库，生物分析仪电泳结果图显示，该方法可以很好地去除终文库引物二聚体，核酸定量仪测定纯化后与纯化前的文库浓度差异无统计学意义。由于有效数据量及数据比对情况对分析结果准确性影响较大，所以在数据分析之前，需要对数据产出量、比对情况、测序深度、覆盖度及测序均一性等指标进行统计，以确定数据的质量及分析结果的可靠性[4]。序列回贴比率是指成功比对回到参考基因组的序列数目占比，可以反映数据的比对情况，12例文库的序列回贴比率均达到100%；测序深度是指目标基因每个碱基被测到的次数，是评价测序质量的指标之一，有效测序深度是指去除PCR重复读取之后的深度，80%以上的目标捕获区域应达到这个深度，中国肿瘤驱动基因分析联盟(CAGC)建议，临床肿瘤组织样本的NGS检测数据中测序有效深度应达500倍以上[5]，本实验12例文库的测序有效深度在508～1 171倍，满足实验要求；插入片段长度是指DNA文库插入片段长度的中位数，体现了原始DNA片段的长度分布，组织样本如果<170 bp则提示DNA存在降解，可能会引入由于DNA损伤造成的假阳性，12例纯化后的终文库插入片段长度在179～262 bp，在可实验范围内。综上所述，本组12例采用AMPureXP磁珠进行纯化的文库相应的测序数据质控均通过，从侧面证明该纯化方法的可行性。利用ARMS-PCR法对12例经过纯化处理的终文库EGFR、KRAS基因常见突变进行验证，结果几乎完全符合，仅1例由于ARMS试剂将19种EGFR的19号外显子缺失类型混合在1个孔进行检测，仅能检出19号外显子缺失而无法区分具体的缺失类型。

总之，本实验应用AMPureXP beads对福尔马林固定石蜡包埋标本终文库进行纯化，既可以很好地去除引物二聚体，又几乎不影响测序质量，笔者认为可以在临床推广，提高NGS实验的成功率，避免重复实验，缩短报告时间，节约测序费用，使得更多的患者受益。