益气清毒消瘤方诱导肠癌细胞凋亡的机制研究

唐晓玲 郭 健 熊林楷 王利勤 熊墨年

1.江西省中医药研究院恶性肿瘤益气清毒重点研究室，江西南昌 330046；2.南昌大学第一附属医院中医科，江西南昌330006；3.江西省肿瘤医院内二科，江西南昌 330029；4.江西省中医药研究院，江西南昌 330046

大肠癌是目前威胁人类健康与生命安全的恶性疾病之一，具有较高的发病率[1]，且早期发病隐匿，加之目前我国国民体检及胃肠道筛查普及率不高，多数肠癌患者确诊时已是中晚期[2]，错过最佳手术时机，并且放化疗除具有较严重的毒副反应外，长时间应用还易导致患者不耐受及耐药等情况，限制了临床的应用[3]。近年来，中医药在各种恶性疾病的治疗中扮演重要角色，成为临床应用及研究的重点和热点[4]。益气清毒法是熊墨年教授基于祖国医学“邪之所凑，其气必虚”和“积之成也，正气不足，而后邪气踞之”理论，在长期的肿瘤临床诊疗与科研实践中形成并提出的治疗肿瘤的学术思想。本研究主要针对益气清毒消瘤方含药血清对大肠癌细胞生长的抑制作用，初步分析其诱导肠癌细胞凋亡的机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验资料

1.1.1 主要仪器和试剂 激光流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、凝胶成像仪均购自Olympus 公司，电泳仪购自北京六一公司；RPMI1640 培养基、单克隆Bcl-2 抗体、单克隆Bax 抗体、单克隆Fas 抗体均购自abcam公司。

1.1.2 益气清毒消瘤方药物制备 太子参15 g，白术15 g、茯苓15 g、甘草6 g、黄芪20 g、白花蛇舌草30 g、半枝莲30 g、藤梨根20 g、败酱草15 g、地榆15 g、枳壳10 g、莪术10 g，加水煎煮1 h，煎液浓缩至1.3 g/mL 生药，冰箱冷藏保存备用。

1.1.3 含药血清制备 本研究经过动物伦理委员会审核同意。采用清洁级18～22 g 雄性昆明小鼠40 只（南昌大学医学部实验动物中心，动物合格证号：190608），随机分为高、中、低剂量组和对照组，每组各10 只，对照组给予0.2 mL的生理盐水，高、中、低剂量组给药量分别为13 g 生药/kg 体重、6.5 g 生药/kg 体重、3.25 g生药/kg 体重，4 组小鼠均灌胃给药3 d，2次/d，于末次给药前12 h 禁食，末次给药后1 h 乙醚麻醉，下腔动脉取血，无菌分离血清，经56℃30 min 灭活，过滤除菌，-20℃冻存备用。

1.2 细胞培养及传代

人大肠癌Wide 细胞系购自中国医学科学院血液研究所，使用含15 %胎牛血清的RPMI1640 培养基，置CO2培养箱培养。每2～3 天传代1次。

1.3 细胞增殖抑制试验（MTT 法）

取对数生长期的细胞，胰酶消化后计数，调整细胞浓度为2×105/mL，接种于96 孔板内，每孔0.1 mL，培养24 h后加入等体积不同浓度血清（高、中、低剂量组和对照组），每组设4个复孔，37℃的CO2培养箱内培养12、24、48 h后，细胞增殖抑制试验（MTT 法）测定各组细胞OD值，计算抑制率，重复3次独立实验。

1.4 细胞凋亡的形态观察

配置0.025%AO-EB 染液，取盖玻片培养细胞，入AO 染液染色5 s，20%乙醇-生理盐水溶液分色2 s，置于载玻片上，蓝光（502 nm）激发，激光共聚焦显微镜（LSCM）观察各组细胞形态。

1.5 流式细胞仪（FCM）检测

1.5.1 细胞凋亡率测定 取经各含药血清处理24 h后的肠癌细胞，胰酶消化后调整细胞数为1×106/mL，按试剂说明每样本分别加入异硫氰酸荧光素标记的磷脂结合蛋白5 μL 和碘化丙啶10 μL，震荡混匀，加入缓冲溶液悬浮细胞400 μL 进行FCM 检测。

1.5.2 蛋白免疫印迹试验（Western Blot）检测凋亡调控基因Bcl-2、Bax、Fas的蛋白表达 含药血清处理24 h 胰酶消化后调整细胞数为1×106/mL，常规处理细胞进行凝胶电泳-转膜-封闭，按细胞内蛋白染色方法，分别加入20 μL的Bcl-2、Bax、Fas 抗体进行抗原-抗体杂交反应，完成后置于凝胶成像仪观察检测结果并拍照。各组蛋白表达强度=每个样本条带的灰度值/β-actin条带灰度值，进行半定量分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验；多组间比较采用单因素分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组培养12、24、48 h后的OD值和抑制率的比较

对照组24、48 h的OD值高于12 h，差异有统计学意义（P＜0.05）；低剂量组48 h的OD值高于12 h，差异有统计学意义（P＜0.05）；低、中、高剂量组培养12、24、48 h的OD值低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；含药血清干预组细胞抑制率呈现时间和剂量依赖趋势（表1）。

2.2 各组细胞形态的比较

AO/EB 染色LSCM 镜下显示，对照组细胞完整，橙色细胞占（3.12±0.13）%；低剂量组细胞膜存在皱缩现象，少量凋亡细胞，橙色细胞占（38.37±7.92）%；中剂量组橙色细胞占（69.16±9.65）%，呈簇出现，细胞膜明显皱缩、细胞质存在空泡、染色质存在块状及边聚现象，凋亡比例升高；高剂量组橙色细胞占（84.64±11.37）%，细胞膜破碎，染色质团块状、边聚，核固缩、核破碎，裸核的坏死细胞比例高于其他三组（图1，封四）。

表1 各组培养12、24、48 h后的OD值和抑制率的比较

2.3 各组细胞凋亡率的比较

含药血清干预组24 h后细胞凋亡率高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；中、高剂量组24 h 细胞凋亡率均高于低剂量组，高剂量组24 h 细胞凋亡率高于中剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2，图2）。

表2 各组细胞凋亡率的比较（%，）

表2 各组细胞凋亡率的比较（%，）

与对照组比较，*P＜0.05；与低剂量组比较，#P＜0.05；与中剂量组比较，&P＜0.05

组别 早期 晚期对照组（n=10）低剂量组（n=10）中剂量组（n=10）高剂量组（n=10）F值P值4.26±0.71 13.75±1.23*19.53±1.34*#29.36±2.04*#&610.848 0.000 1.06±0.56 7.94±1.65*10.38±1.93*#14.81±1.83*#&143.318 0.000

图2 各组细胞24h后早期细胞凋亡流式检测

2.4 各组细胞凋亡调控基因Bcl-2、Bax、Fas的蛋白表达的比较

含药血清干预组细胞凋亡调控基因Bax、Fas表达高于对照组，Bcl-2表达低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；中、高剂量量组细胞凋亡调控基因Bax、Fas表达高于低剂量组，Bcl-2表达低于低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）；高剂量量组细胞凋亡调控基因Bax、Fas表达高于中剂量组，Bcl-2表达低于中剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3，图3）。

表3 各组细胞凋亡调控基因Bcl-2、Bax、Fas的蛋白表达的比较（）

表3 各组细胞凋亡调控基因Bcl-2、Bax、Fas的蛋白表达的比较（）

与对照组比较，*P＜0.05；与低剂量组比较，#P＜0.05；与中剂量组比较，&P＜0.05

组别 Bax Bcl-2 Fas对照组（n=10）低剂量组（n=10）中剂量组（n=10）高剂量组（n=10）F值P值0.17±0.02 0.33±0.06*0.56±0.04*#0.81±0.05*#&459.830 0.000 1.06±0.08 0.67±0.07*0.45±0.09*#0.21±0.06*#&266.354 0.000 0.11±0.03 0.39±0.05*0.51±0.09*#0.73±0.07*#&173.384 0.000

图3 各组细胞凋亡调控基因Bcl-2、Bax、Fas 蛋白的表达

3 讨论

近年来，随着祖国医学在肿瘤领域的不断进展，中医药在恶性肿瘤治疗中越发重要[5]。熊墨年教授基于多年的科研和临床实践，提出“益气清毒法”治疗肿瘤的学术思想，其益气清毒消瘤方以中医扶正祛邪和脾枢机理论为基础，以四君子汤健脾益气、运转枢机、激发和调理脏腑功能为核心，兼以消除毒邪、消肿散结，提高机体免疫和抗肿瘤能力，全方用药轻柔，如清涤污浊，达到扶正不留邪，攻邪不伤正的目的[6]。临床以此方为基础视肿瘤侵犯脏器的情况而辨证加减，产生良好的效果。

肠癌相当于中医“肠蕈”“脏毒”“锁肛痔”“积聚”等范畴，病机特点多为本虚标实和虚实夹杂，脾虚和肾虚是虚之本，气、湿、痰、瘀、毒为实之标[7]。中医认为，脾胃为后天之本，气血生化之源，气虚则受纳与健运乏力，加之湿浊内生，脾胃运化不利则引起肠胃等诸多疾病[8]。四君子汤组方以太子参为君，甘温益气，健脾养胃；臣以苦温之白术，健脾燥湿，加强益气助运之力；佐以甘淡茯苓，健脾渗湿，苓术相配，则健脾祛湿之功益著；使以炙甘草，益气和中，调和诸药，益气健脾之功[9]。另黄芪包括苷类、多糖、黄酮、叶酸及多种微量元素具有抗肿瘤、调节免疫、抗氧化等多种作用[10]；白花蛇舌草包含蒽醌、萜类、黄酮、香豆素、苯丙素、多糖等多种化学成分，具有调节炎性反应、抗肿瘤、抑制血管生成等多种作用[11]；半枝莲具有调节免疫力、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡等作用[12]；藤梨根清热利湿，祛风除痹，解毒消肿，在消化系癌肿中应用广泛[13]；败酱草具有清热解毒，祛痰排脓之功[14]；地榆解毒敛疮[15]；枳壳理气宽中，行滞消胀[16]；莪术破血祛瘀行气、消肿止痛[17]。全方用药轻柔，以四君子汤为核心，健脾益气、调理脏腑，兼以诸药消除毒邪，调理机体免疫和抗肿瘤能力。

本研究结果显示，益气清毒消瘤方对大肠癌细胞生长具有明显的抑制作用，细胞抑制率呈现时间和剂量依赖趋势，并且能够破坏肠癌细胞结构，增加细胞凋亡率，同样呈现明显的量效相关性，进一步证实益气清毒消瘤方在大肠癌中的治疗作用。本研究对Bcl-2、Bax、Fas的蛋白表达进行了检测，Bcl-2、Bax 为同属家族，但二者作用相反，Bcl-2 为凋亡抑制基因，Bax 为凋亡促进基因[18]，Fas 属于死亡受体家族，是一种跨膜蛋白[19]。现已证实，包括肠癌在内的多种恶性肿瘤Bcl-2、Bax、Fas 均异常表达[20]，并且存在相互关联。本研究结果显示，对照组Bax、Fas 明显低表达，Bcl-2 高表达，提示肠癌细胞可能存在凋亡与增殖失衡，从而促进癌细胞的生长和增殖。此外，含药血清干预组细胞凋亡调控基因Bax、Fas表达高于对照组，Bcl-2表达低于对照组，且随剂量的升高Bax、Fas表达升高，Bcl-2表达降低，呈现明显的量效相关性。因此，有理由认为益气清毒消瘤方可能通过调控肠癌细胞Bax、Fas的高表达、Bcl-2 低表达干预细胞结构，使细胞膜破碎，染色质团块状、边聚，核固缩、核破碎，从而诱导细胞凋亡。

综上所述，益气清毒消瘤方能够明显抑制肠癌细胞的生长和增殖，有效提高细胞凋亡调控基因Bax、Fas表达，抑制Bcl-2表达，促进细胞凋亡，为益气清毒法治疗大肠癌提供了可靠的实验数据。