阿兹海默症对小鼠不同类型学习记忆功能的影响

邓加艾，李霜，赵溪岩，勾洵通信作者)

（1.海南医学院基础医学与生命科学学院，海南 海口 571199；2.四川师范大学生命科学学院，四川 成都 610101）

0 引言

阿兹海默症（Alzheimer's disease, AD）是一种最常见的中枢神经系统退行性疾病，起病隐秘，病程缓慢，罹患痴呆症患者中50%～70%为此类病症[1]。阿兹海默症的病因及发病机制复杂，至今尚未明确，其特征性病理改变为在脑组织内β淀粉样蛋白沉积形成和tau 蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结等[2,3]。患者常表现为认知功能障碍，严重影响患者学习记忆能力[4]。

研究学习记忆行为学方法有多种，其中空间学习记忆研究方法常见的有Morris 水迷宫实验（Morris water maze,MWM），非空间学习记忆研究方法常见的有新物体识别实验（Object Recognition Test, ORT）。Morris 水 迷 宫 实 验 由Morris 1981 年发明[5]，为一种迫使实验动物（如小鼠）在圆形池子里游泳，重复寻找水中特定平台的实验方法，常见于对空间位置和空间定位的测试。一般分有持续训练、定位航行和空间探索三个阶段，并对实验动物的运动轨迹进行追踪与拍摄，采用相关软件对运动数据进行分析与统计[6]。新物体识别实验是利用动物先天具有对新物体探索倾向的能力而建立的学习记忆测试方法[7]。在特定形状（可为圆形、矩形、Y 型等）的场地内放置对称的两个完全相同的物体，一段时间内观察实验动物（如小鼠）探索物体时长与次数，几天后将其中一个物体替换成新事物，观察实验动物探索新事物与旧物体的次数与时长，对实验动物的运动轨迹进行追踪与拍摄，记录数据[8]。

现有研究[9-12]多为探讨不同药物对阿兹海默症患者的治疗效果，而其对不同类型学习记忆影响的差异尚未可见，本研究通过阿兹海默症对小鼠空间学习记忆与非空间学习记忆功能损伤的差异，探讨阿兹海默症对不同类型学习记忆功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌雄C57BL/6J SPF 小鼠，购于成都达硕实验动物有限公司[生产许可证：SCXK（川）2015-030]，（20±2）g，室温：（20±2）℃，自由进食和进水。

1.2 仪器与药品

Morris 水迷宫系统购于淮北正华生物仪器设备公司，万分之一电子天平购于北京赛多利斯科学仪器有限公司，台式低温冷冻离心机购于湘仪实验室仪器开发有限公司，β-淀粉样蛋白 (Aβ)购于Sigma，戊巴比妥钠与氨水均购于北京索莱宝。

1.3 Aβ25-35 寡聚体的制备

取Aβ 1 mg，4℃静置30 min，加入六氟异丙醇1 mL 溶解，静置2 h，超声；14000 rpm 离心20 min，取上清；液氮冻实后，冷冻干燥12 h，得到处理好的絮状Aβ；200 L 1%氨水溶解，37℃孵育72 h；同时取4 mL 溶解后的液体用BCA 试剂盒测定蛋白浓度；取出孵育好的Aβ，依照测定浓度用0.01 M PBS稀释至1 mg/mL。

1.4 分组与动物模型构建

取24 只小鼠，雌雄对半，随机分为四个组：雌性AD 组，雌性对照组，雄性AD 组，雄性对照组，每组各6 只。小鼠在恒温、恒湿的SPF 级动物房中适应性饲喂1 周，严格控制12 h光照/黑暗，环境温度设定为24°C，适应期间小鼠自由进食和进水。

1 周后将小鼠称重麻醉后台面上，用手术刀沿小鼠头中逢做一小切口；使用脑定位仪确定小鼠头部海马区位置；用颅钻钻孔，左右各1 个，深度2 mm。旋转脑定仪上的卡尺，移动微量注射泵至小鼠双孔上空，待进样针抵住小鼠头皮后，进针深度为3～4 mm；雄性AD 组与雌性AD 组小鼠以1 μL/min恒速注射1.5 μL Aβ25-35；雄性对照组与雌性对照组则注射同等计量含有氨水与PBS 相同比例的溶液；留针30 s，缓慢退针，退针后用牙科胶覆盖小孔；缝合，术后3 d 连续腹腔注射青霉素钠防止感染。一般有持续训练、定位航行和空间探索三个阶段，

1.5 Morris 水迷宫实验

药物干预4 周后进行水迷宫实验。水迷宫深80 cm，直径180 cm，液体为牛奶稀释液，实验分为3 个阶段。第一阶段是为时3 d 的持续训练阶段，小鼠面向池壁，从第一象限放入水中，让其在90 s 内自由寻找第三象限的平台，每天3 次，不记录实验时间；如果小鼠在90 s 内无法找到平台，需用木棍将小鼠以直线距离引导至平台休息30 s。第二阶段是连续5 d 定位巡航阶段，同一位置面向池壁放入小鼠，记录其找到并登上平台的时间（逃避潜伏期，Escape Latency），重复3 次。第三阶段是为时1 d 的空间探索实验，撤去平台，记录小鼠在90s 内穿越过原平台位置的次数。采用Morris 水迷宫图像自动监视处理系统完成数据的采集和处理。

1.6 新物体识别测试

本实验采用40*40*50cm 白色开口木箱。第1 d 木箱中不放置任何物体，将每只小鼠放入场地中央自由活动5 min，以方便小鼠适应新环境。第2～3 d 进行训练，将A，B 两个完全相同的物体以相互对称的方式放置在木箱的两端，小鼠从A、B 两个物体相等的位置以背对的方式放入场地内并记录小鼠探索情况，包括鼻子或嘴巴触碰物体的次数和时间，试验时长为5 min，记录小鼠的探索情况。第4 d 将场地内的B 物体换作不一样的C 物体，放入小鼠，记录其对C 物体探索情况，观察5 min。

新物体探究识别指数(RI)=探索新对象时间/(探索新对象时间+探索熟悉对象时间)×100%。

1.7 统计学分析

数据均用Graphpad prism 5 处理，以均数±标准差（±s）进行分析，组间显著性差异采用t检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 阿兹海默对小鼠空间学习记忆的影响

2.1.1 阿兹海默对小鼠逃避潜伏期的影响

图1（A）中1～5 d，雄性AD 组逃避潜伏期高于雄性对照组（P＜0.05），且天数越大，逃避潜伏期所用时间越长；图1（B）中前3 d，雌性AD 组逃避潜与其对照组小鼠没有显著性差异（P＞0.05），在第4～5 d，雌性AD 组逃避潜伏期高于其雌性对照组（P＜0.05）；图2 可以看出，雄性对照组、雌性对照与雄性AD 组的逃避潜伏期曲线均有不同程度下降，而雌性AD 组曲线趋势变化相对不明显。

图1 阿兹海默对小鼠逃避潜伏期的影响

图2 不同天数小鼠逃避潜伏期趋势图

2.1.2 阿兹海默对小鼠穿越平台次数的影响

图3 中，雄性对照组穿越平台次数高于雄性AD组（P＜0.05），雌性对照组与雌性AD 组无明显差异（P＞0.05）。

图3 阿兹海默对小鼠穿越平台次数的影响

2.2 阿兹海默对非空间学习记忆的影响

2.2.1 阿兹海默对小鼠新物体识别能力的影响

图4 中可以看出，雄性对照组小鼠RI 值明显高于雄性AD 组小鼠（P＜0.05），雌性亦然（P＜0.05）。

图4 阿兹海默对RI 值的影响

3 讨论

阿兹海默症是神经性退行性疾病中最主要的病症之一，是危害中老年人健康的重要病症[13-14]。在水迷宫实验中雄性AD 组小鼠逃避潜伏期（图1A）与穿越平台次数（图3）均明显高于其对应的对照组，说明阿兹海默症对雄性小鼠的空间记忆功能有损伤。同时表明水迷宫实验可成为判断雄性小鼠AD 模型建造是否成功的行为学检测方法。

而雌性AD 组与其对照组小鼠在水迷宫实验中，第4～5 d，逃避潜伏期（图1B）存在显著性差异，而穿越平台次数（图3）无明显差异。其中逃避潜伏期实验需测试小鼠寻找到平台并登上平台的时间。而穿越平台次数是将平台隐藏，测试小鼠90 s 内穿越隐藏平台的次数，在该实验中，小鼠无需登上平台。因此，逃避潜伏期实验中造成结果显著性差异的因素还包括实验过程中由于小鼠体力等因素导致爬上平台所花费时间差异，而不是单纯测试小鼠对平台位置记忆能力。雌性小鼠AD 组与对照组，在平台穿越次数实验中无显著性差异，由此说明阿兹海默症对雌性小鼠的空间记忆功能损伤程度较小或不明显。同时，水迷宫实验能否成为判断雌性小鼠AD 模型建造成功的行为学检测方法有待进一步探究。

在新物体识别测试中，小鼠对新物体触碰的时间越长说明其对新物体的学习能力越强，RI 值也越大[15]。两组对照组的RI 值均明显高于其对应的AD 组（图4），说明AD 小鼠对新事物学习认知能力比对相应对照组照组差，揭示阿兹海默症对雄性和雌性小鼠的非空间学习记忆均产生损伤。同时表明新物体识别实验可成为判断雄性和雌性小鼠AD 模型建造是否成功的行为学检测方法。

综上实验，阿兹海默症对雄性小鼠空间学习记忆与非空间学习记忆能力都存在影响，而对雌性小鼠空间学习记忆能力影响不显著，对其非空间学习记忆能力影响较大。