基于PCR熔解曲线技术的结核分枝杆菌Spoligotyping基因分型的临床应用研究

蓝如束,叶 婧,罗 丹,覃慧芳,黄莉雯,苏华斌,罗淋尹,林 玫

结核病仍然是严重危害人类健康的传染病之一，每年大约有1 040万人感染，140万人死于结核，形势十分严峻[1]。近年来，结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)基因分型方法普遍用于结核病疫情处置和结核病分子流行病学研究。目前，用于MTB基因分型的主要方法有限制性片段长度多态性(IS6110-RFLP)、间隔区寡核苷酸分型技术(Spoligotyping)、可变串联重复序列技术(VNTR)等[2]。这些方法普遍操作繁琐、耗时长、结果判读主观性大，操作人员需要经过严格培训。其中间隔区寡核苷酸分型技术(Spoligotyping)方法是最常用基因分型方法之一，传统检测技术是利用PCR方法扩增间隔序列，扩增产物与固定在杂交膜上的 43 个合成的间隔序列捕获探针杂交，根据显影结果判读相应的间隔序列是否存在，进而得到菌株的基因型特征。其操作步骤多且非常繁琐，结果需要人工判读。近两年来，厦门致善公司研制出一种利用PCR熔解曲线技术对结核分枝杆菌进行spoligotyping基因分型，该技术仅需3 h完成检测，实现结果自动化判读。本研究旨在应用Mcspoligotyping方法对临床样本进行检测，评价其在结核病疫情处置及结核病分子流行病学研究中的应用价值。

1 材料和方法

1.1标本来源 949株菌株来源于2017年广西结核病耐药监测，监测期间收集临床病人痰标本，应用罗氏培养基传统固体分离培养方法获得阳性培养物，经硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)鉴别培养基确定为MTB。质控标准菌株H37Rv由中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室提供。……