布鲁氏菌微滴式数字PCR方法的建立与应用

田国忠，姜 海，薛盼盼，朴东日，赵鸿雁，杨晓雯，张京云

布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，是由细胞内寄生的布鲁氏菌(Brucella)引起的一种人兽共患传染-变态反应性疾病，可感染多种家畜、家禽和野生动物，其中与人类密切相关的动物主要有羊、牛、猪和犬等。病畜的血液、分泌物、排泄物、流产物及乳类含有的致病菌，可在动物间传播，造成感染发病；传染到人，可引起人体感染，出现临床症状。目前布鲁氏菌的检测方法主要有：细菌的分离培养、布鲁氏菌抗体检测(试管凝集试验)和分子生物学检测(常规PCR、荧光定量PCR和环介导等温扩增技术)等。细菌的分离培养和血清学诊断技术是经典方法，但存在着检测周期长、操作繁琐、易漏检和潜在生物危害等缺点。常规PCR方法需要凝胶电泳分析，容易发生PCR产物的实验室污染，并且灵敏性低；荧光定量PCR具有较高的灵敏性，但是血液等标本中经常存在的PCR抑制因素影响了荧光定量PCR的实际应用[1-2]；环介导等温扩增技术由于引物间的非特异性扩增而易产生假阳性结果。微滴式数字PCR方法(Droplet digital PCR，ddPCR)是近年来发展起来的快速、准确、可实现DNA绝对定量的PCR方法，已经广泛应用于细菌和病毒的检测[3]。本研究建立了布鲁氏菌的ddPCR方法，可实现对布鲁氏菌核酸DNA快速、准确的定量检测，适合布病临床标本和布病的分子流行病学调查。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 微滴式数字PCR系统QX200 Droplet Digital PCR(Bio-Rad，美国)包括微滴生成仪、微滴分析仪、封膜仪和Quanta Soft V1.7.4软件。其它设备：荧光定量PCR仪(LightCycler 4800II，Roche，美国)，普通PCR扩增仪(LabcyclerK，SENAQUEST，德国)和DNA微量分光光度测定仪(spectrophotometer NanoDrop 1000，美国)。……