寻常型银屑病不同证候外周血miR-146a的差异表达研究*

梁 育 沈丹丹 邱桂荣

银屑病(Psoriasis Vulgaris，PV)，中医称为“白疕”，俗称牛皮癣，以皮肤红斑、丘疹或斑片上盖有银白色鳞屑，不同程度的瘙痒为主要表现。其发病机制非常复杂,目前认为炎症、表皮细胞过度增殖和免疫学异常是其发病机制的3个中心环节[1]。随着国内外学术界在miRNA领域研究的逐步深入，发现多种miRNA在皮肤生理病理等过程中发挥了极其重要的作用。通过前期研究我们也发现miRNAs在银屑病皮损、单个核细胞中均存在特异性差异表达。近年来，对正常人与不同疾病的患者血浆中miRNAs进行检测，发现存在差异性表达的miRNAs，并且随着生理情况、疾病种类以及病程的长短而变化，这就证实血循环miRNA是潜在的诊断标志物[2]。本人前期通过miRNA RealTime RT-PCR实验验证miRNA在正常人与银屑病患者血浆中的表达差异，确定出5个差异倍数大于4的miRNA，其中miR-146a表达上调，且与银屑病PASI积分呈正相关。故本次课题将研究人群扩大，不再是单纯的血热型患者，而是观察不同中医证候的银屑病患者外周循环血miRNA-146a的差异性表达，以60例寻常型银屑和20例健康人为研究对象，首先观察个体中外周血miRNA-146a的表达水平，其次，将患者外周血中miRNA-146a的表达水平与其皮损面积和严重程度指数(PASI)作直线相关分析，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取江西中医药大学附属皮肤科2018年6月—2019年6月门诊和住院部确诊为寻常型银屑病的患者60例。将受试者按照中医证候不同随机分成3组，且性别、年龄必须经处理差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入与排除标准纳入标准：符合以上西医诊断标准和中医证候标准；年龄18～60岁者；无其他皮肤疾患及心、肝、肺、肾、血液等系统性疾病者。排除标准：年龄小于18岁或大于60岁者；妊娠或哺乳期妇女；对治疗药物过敏者；合并有心、肝、肾、肿瘤等严重原发性疾病者；4周内未接受过糖皮质激素、免疫抑制剂、维A酸类及PUVA/UVB治疗，2周内未使用外用制剂局部治疗者。

1.3 西医诊断标准及PASI评分法①具有典型的临床表现：皮损以丘疹、斑丘疹和大小不等的红色斑块为主，覆有多层干燥银白色鳞屑，刮除鳞屑可见一层发亮的薄膜，薄膜下可有点状出血，不断有新皮疹出现。进行期有同形反应，好发于头皮、四肢伸侧及腰骶部，但可发生在体表各处，发于头皮者，毛发呈束状；发于甲板(指、趾)者，可有顶针样甲损害。依皮损形态可分为点滴状、钱币状、地图状或混合型；依病程可分为进行期、静止期和退行期[3]。②PASI评分法：皮损情况依据Fredriksson T和Petersson U指定的皮损面积和严重性指数(Psoriasis area and severity index,PASI)评分法。

1.4 中医辨证标准参照中华中医药学会2012年颁布的《中医皮肤科常见病诊疗指南》中白疕的辨证标准：①血热内蕴证。皮疹鲜红，不断出现，刮去鳞屑可见发亮薄膜，点状出血，有同形反应。可有不同程度瘙痒，伴有心烦口渴、尿黄、大便秘结。舌质红，舌苔黄或黄腻，脉弦滑或数。②血虚风燥证。疹色淡红，鳞屑较多而干燥，病程迁延日久，原发皮损部分消退。可有瘙痒、口干咽燥、大便干结。舌质淡红，苔薄白，脉细。③瘀滞肌肤证。皮损肥厚浸润，颜色暗红，鳞屑紧固。病程迁延，斑块局限经久不退，有不同程度瘙痒，舌质暗红，苔薄，脉细涩[4]。

1.5 方法

1.5.1 miRNA-146a的检测抽取患者外周血5 ml，根据Trizol说明书进行总RNA提取，对其质量检测采用NanoDrop测定，1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。然后对提取的总RNA进行反转录合成cDNA，反应步骤为：在PCR仪上16 ℃ 10 min，37 ℃ 30 min，65 ℃ 5 min，收集荧光。为尽量减小逆转录、PCR反应及样品间的差异，以看家基因RNU6为内参基因来标准化样品，分别进行目的基因和看家基因的PCR，数据采用 2-△Ct法进行分析。

1.5.2 统计学方法采用SPSS 16.0软件包进行分析，定性资料用卡方检验，定量资料符合正态分布用t检验，不符合正态分布用秩和检验，相关性用Pearson相关性分析。以P≤0.05为差异有统计学意义，以P≤0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 3组银屑病患者与正常对照组外周血miRNA-146a的差异表达在3型寻常型银屑病患者的PBMC中，miRNA-146a的相对表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(t=2.68，P<0.01)，miRNA-146a在血热型患者表达水平高于血瘀组和血燥组患者，差异有统计学意义(t=2.34，P<0.01)，但血瘀组和血燥组差异无统计学意义。见表 1。

表1 各组受试者PBMC中miRNA-146a的表达水平

2.2 3组银屑病患者外周血microRNA-146a的表达与PASI积分的相关性3组寻常型银屑病患者的PBMC中miRNA-146a表达水平与银屑病严重程度评分PASI呈正相关(r=0.68，P<0.05)。见图1。

图1 miRNA-146a与PASI积分的相关性

3 讨论

银屑病(Psoriasis Vulgaris，PV)是一种多因子遗传模式的复杂疾病，涉及多个基因间的相互作用以及基因与环境的交互作用。从药物治疗手段上来看，维A酸类药物、传统免疫抑制剂、细胞/趋化因子抗体等药物的作用靶环节相对单一以及各自不同的不良作用，使治疗效果及临床运用尚不能完全令人满意。传统的中医中药对银屑病的治疗有着一定的优势，且对中医证候的认识也形成公认的标准。前辈先贤们多以“辨血为主，从血论治”[5，6]，且实践证明这种辨证对于治疗也是行之有效的。虽然中西医的理论基础不同，但研究对象是一致的，所以从某种意义上说，两者之间必然存在着共同的物质基础。因此，我们需要寻找新的靶分子及适当的抑制途径，从而为开辟银屑病新的研究领域和探寻银屑病新的治疗手段提供理论依据。

miRNA是近年来发现的最小功能的非编码小分子RNA，其参与了生命的一系列重要过程，包括发育进程、造血过程、脂肪代谢、器官形成、细胞增殖和凋亡等。以miRNA为靶点或者以miRNA为治疗手段的研究也正在进行中，这些研究有助于人类疾病的早期诊断、疗效及预后预测，同时也为人类疾病的治疗提供了一种新的手段和方法[7]。miR-146a是一个在银屑病中高表达的miRNA，作为一个负调控分子，可以通过互补结合于TRAF6和IRAK1的3’UTR，在转录后水平抑制TRAF6和IRAK1的水平，从而对天然免疫应答中的细胞内信号转导起负反馈调节作用[8]。

通过前期研究，我们发现miRNAs在血热型银屑病的皮损、外周血中均存在差异性表达，且与PASI呈正相关。考虑疾病诊治的整体性和全面性，且地域差异过于明显，所以我们不再局限于血热型患者，参考中医证候诊断标准，纳入了23例血热型、20例血瘀型、17例血燥型患者，对其PMBCs中miRNA-146a的表达水平进行检测，并将结果与患者PASI积分作直线相关分析，结果显示在3型寻常型银屑病患者的PBMCs中，miRNA-146a的相对表达水平明显高于对照组，且血热型患者表达水平高于血瘀组和血燥组患者，但血瘀组和血燥组差异无统计学意义，且miRNA-146a的表达水平与银屑病严重程度评分(PASI)呈正相关。

综上所述，miRNA-146a的水平与银屑病患者临床皮损症状严重程度密切相关，可以作为判断病情和临床治疗效果的生物学指标之一。考虑到所有研究对象均来自同一所医院，这可能会影响研究对象的代表性，造成地区选择上的偏倚。另外，纳入的样本量相对较小，可能会削弱研究结果的统计学意义，故下一步有必要扩大样本量研究。