不同相对分子质量透明质酸对还原型谷胱甘肽透皮吸收的影响

唐泽严，郭学平，温喜明，王玉玲*，吕慧侠**

（1中国药科大学药学院药剂系，南京211198；2山东华熙海御生物医药有限公司，济南250010）

透明质酸（hyaluronic acid，HA）又称玻尿酸，是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位的糖胺聚糖。D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间由β-1，3-配糖键相连，双糖单位之间则由β-1，4-配糖键相连。HA的相对分子质量可由5 000～2×107Da之多，因其独特的保湿（可以吸收其质量1 000倍的水分）、润滑和促进细胞修复等功能［1-2］，HA已经被广泛应用于医药和化妆品领域，发挥其美容保健、关节腔润滑以及组织再生等功能［3］。此外还有报道表明，HA可以促进某些药物的经皮吸收，Son等［4］用低相对分子质量透明质酸结合十二烷胺包裹吲哚菁绿制备成水凝胶后，增强了离体猪皮角质层、活性表皮层和真皮层中的滞留。Yue等［5］用改良的透明质酸制备负载布比卡因的纳米脂质体，体外皮肤渗透实验表明，72 h内相比于对照组经皮透过量提高了2.5倍。

还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。GSH存在于机体的每一个细胞中，半胱氨酸上的巯基能与某些药物和毒素（如自由基、芥子气和各种铅汞砷等重金属）等结合，发挥解毒的作用；GSH还能帮助人体保持机体正常的免疫系统功能；并且由于其抗氧化能力，还被应用于化妆品中发挥美白祛斑抗过敏的功效［6-8］。但由于GSH水溶性好（50 mg/mL），油水分配系数低（lg P=-0.87），难以透过皮肤角质层的特点，其在经皮给药领域研究较少。

与透皮给药系统（发挥全身作用的药物制剂）不同的是，治疗局部皮肤疾病的药物，如治疗皮肤癣的抗真菌类药物，希望其可以更多的进入角质层，并储留于角质层中发挥抗真菌的作用，并且药物尽可能少的进入真皮，被毛细血管吸收进入全身血液循环，从而可以尽可能少的产生全身副作用；对于作用于皮肤不同层次的化妆品中功效成分，如保湿剂则可能希望药物在角质层中储留发挥保湿作用，美白成分则作用于基底层中的黑色素细胞，营养和抗皱类成分则尽可能的停留于真皮中。目前大多关于经皮给药的研究更多的是关注难溶性的药物或功效成分，如何采用新制剂或新剂型［9-14］，促进其的透皮吸收，但对于药物在皮肤不同层次中的储留情况，则少有报道。而在外用制剂和化妆品中，又常常会加入海藻糖、透明质酸等多糖或纤维素衍生物，作为增稠剂或保湿剂使用。这些成分的加入，对于水溶性药物，两者之间是否存在相互作用，是否会改变这些水溶性药物的透皮吸收行为，值得研究。本研究以水溶性好、难透皮吸收的GSH为模型，考察不同相对分子质量的HA对GSH在离体鼠皮的皮肤渗透与储留的影响，并采用分子对接AutoDock和傅里叶衰减全反射红外光谱、HE切片染色等方法探讨HA与GSH的相互作用以及HA对皮肤结构的影响，从而为HA等水溶性多糖材料在外用制剂或化妆品中对药物的经皮渗透和储留的影响提供一定的借鉴。

1材料

1.1 药品与试剂

还原型谷胱甘肽（阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：K1728038，纯度：98%），透明质酸7K、42K、360K、920K（相对分子质量分别为7×103、4.2×104、3.6×105、9.2×105华熙生物科技股份有限公司，批号：1810071），透明质酸90K（相对分子质量分别为9×104大连美伦生物，批号：M0504A），5，5′-二硫双-2-硝基苯甲酸（阿拉丁，批号E1922062），磷酸二氢钾（江苏永华化学科技，批号：20190103），氯化钠（广东西陇科学，批号：190305-1），实验用水为超纯水，其他试剂均为市售分析纯。

1.2仪器

LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；LOGAN干加热透皮扩散仪DHC-6TD（美国禄亘仪器公司）；RYJ-12B型药物透皮扩散试验仪（上海黄海药检仪器公司）；高通量组织研磨仪（南京贝蒂实验仪器公司）；雷磁PHS-3CpH计（上海仪电科学仪器公司）；D3024R高速离心机（北京大龙实验仪器公司）；Vortex 2圆周震荡器（德国IKA公司）；Vertex 70傅里叶变换全反射光谱仪（德国布鲁克公司）。

1.3动物

SD大鼠［许可证号码：SCXK（沪）：2018-0006］由南京青龙山动物繁育场提供，所有动物实验操作均符合中国药科大学伦理委员会标准；实验动物从业人员上岗证号：220193856。

2方 法

2.1 GSH含量测定方法学的建立

2.1.1 GSH柱前衍生化 采用5，5′-二硫双-2-硝基苯甲酸（DTNB）衍生化试剂与GSH进行反应，再通过HPLC测定了透皮吸收液与皮肤组织中的GSH［15］。样品中GSH的巯基与DNTB反应生成衍生化产物，在偏酸性流动相中，在紫外区有吸收，利用紫外检测器能够灵敏的检出良好的色谱峰，借此可以鉴定GSH的含量［16］。

2.1.2 色谱条件 色谱柱：岛津Shim-pack GISC18色谱柱。流动相为二元梯度流动相体系A：0.025%磷酸二氢钾（pH 3.8）；B：甲醇，梯度洗脱程序：12%B（0～3 min）→8%B（3.01～4.5 min）→40%B（8.5～15 min）→12%B（15.01～20 min）；流速1 mL/min（0～3 min）→0.6 mL/min（3.01～4.5 min）→0.8 mL/min（8.5 min）→1 mL/min（15～20 min）。进样量20µL，柱温为39℃，检测波长：330 nm。

2.1.3 标准曲线的建立 精密称取GSH 10.13 mg，置于10 mL量瓶中，空白皮肤接受液溶解并稀释至刻度，摇匀，制备成储备液。分别精密量取0.1、0.5、1、2、5 mL储备液，置于10 mL量瓶中，用空白皮肤接受液定容，得到1.01、5.07、10.13、20.26、50.65µg/mL的对照品溶液。精密量取上述对照品溶液1 mL，加入100µg/mL DTNB溶液1 mL并涡旋3 min，取反应液20µL分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以GSH质量浓度（µg/mL）为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归。取2.2 cm2皮肤剪碎加入20.26、50.65、202.6、506.5、1 013.00µg/mL GSH标准溶液1 mL，液氮冷冻后匀浆，12 000 r/min高速冷冻离心12 min，取匀浆液500µL，加入甲醇沉淀剂500µL，于12 000 r/min高速冷冻离心12 min。再取上清液500µL最后加入1 mg/mL DTNB衍生化试剂0.5 mL涡旋反应3 min，取反应液20µL分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以GSH质量浓度（µg/mL）为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归。

2.1.4 溶液稳定性 取质量浓度为50.65µg/mL的GSH对照品储备液1 mL，与TNB 1 mL反应后在1、2、4、6、12、24 h分别进样20µL，记录色谱峰面积，与0 h峰面积进行比较，计算RSD。

2.1.5 进样精密度 取质量浓度为50.65µg/mL的GSH对照品储备液，与1 mL DTNB反应后，连续6次注入色谱仪（n=6），记录峰面积，计算RSD。

2.1.6 回收率 取数份2.2 cm2空白皮肤剪碎，分别加入高、中、低3种质量浓度（1 013.00、506.50、200.65µg/mL）对照品溶液，每个质量浓度配备3份（n=3）。匀浆操作参考“2.1.3”项下，测定药物含量，计算提取回收率。

2.2 不同相对分子质量HA对GSH体外透皮吸收与皮肤不同层次储留性能的影响

2.2.1 GSH在离体皮肤中的透皮吸收 将处理好的鼠皮从冰箱中取出，用生理盐水泡至室温，切割并固定在扩散池上。真皮一侧与接收液接触，角质层面向供给池。磁力搅拌速度为400 r/min，水浴温度为（32±0.5）℃。接收池加入生理盐水溶液6.5 mL，供给池分别加入含有1%的7K、42K、90K、360K、920K相对分子质量的HA与GSH（0.125 mmol/mL）的溶液2 mL，分别于1、2、4、6、8、10、12 h时从接收池中取出接受液1 mL，同时向接受池中补加等量的接收液。取出1 mL接收液后加入DTNB溶液1 mL反应涡旋反应3 min，进样前0.45µm微孔滤膜过滤。

2.2.2 不同层次离体皮肤中GSH储留量 与“2.2.1”项下相同方法处理皮肤和给予相同样品后，分别于1、4、8、12 h取出皮肤，用生理盐水清洗皮肤3次后用胶带粘贴法［17-18］粘贴表皮20次，将角质层部分粘下，并将胶带置于20 mL生理盐水中浸泡提取12 h，取提取液2 mL高速离心，再取1 mL上清液与1 mL 1 mg/mL DTNB衍生化试剂涡旋反应3 min，进样前0.45µm微孔滤膜过滤。除角质层外的活性真皮部分剪碎后加入生理盐水溶液1 mL，液氮冷冻后匀浆，12 000 r/min高速冷冻离心12 min，取匀浆液500µL，加入500µL甲醇溶液，于12 000 r/min高速冷冻离心12 min。再取上清液500µL最后加入1 mg/mL的DTNB衍生化试剂0.5 mL涡旋反应3 min，进样前0.45µm微孔滤膜过滤。

2.3 HA影响药物经皮吸收的机制研究

2.3.1 分子对接 利用分子对接软件AutoDock进一步研究HA单体与GSH的相互作用，从而进一步解释HA对GSH透皮吸收行为产生影响的原因。使用ChemDraw画出HA和GSH结构式，并进行MM2运算使其能量优化。使用AutoDockTools对GSH与HA进行分子模拟，AutoDock的拉马克遗传算法（Lamarckian genetic algorithm，LGA），可以识别分子间的相互作用力，从而计算出可能的构象。进一步判断两分子间的相互作用。

2.3.2 全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）取0.25 cm2皮肤置于0.2%胰酶磷酸盐缓冲液（pH 7.4）的24孔板中，真皮面与底部接触，于37℃经8 h孵育，直到真皮部分被移除。用棉签将角质层从糊状物中分离，将分离的角质层用水清洗，在真空干燥器中干燥24 h干燥后即可得分离的角质层［19］。分别取大小适宜的干燥角质层片，分别置于6孔板内。对照组（生理盐水溶液），处方组（1%不同相对分子质量的HA生理盐水溶液）。分别取干燥角质层片至于3 mL各组对应的溶液中，室温条件下孵育12 h后，用蒸馏水清洗掉角质层片上的残留溶剂，放置于真空干燥（硅胶）干燥12 h，干燥后的角质层片采用衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）进行扫描测定，仪器参数设置为：分辨率2 cm-1，扫描次数100，扫描范围为650～4 000 cm-1［20］。

2.3.3 HE染色法研究HA对皮肤微观结构的影响 分别设置空白组，1%的不同相对分子质量的生理盐水HA溶液组。雄性大鼠乌拉坦麻醉后小心剃去腹部毛使皮肤暴露，大鼠腹部分别给予上述6组样品100µL，8 h后处死大鼠，剥取经上述样品涂布的皮肤，除去皮下脂肪，用生理盐水清洗后置于4%多聚甲醛中固化24 h。依次将样品脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烘干、脱蜡后，HE染色脱水透明封片。

3结果

3.1 GSH方法学

3.1.1 GSH标准曲线 实验结果表明，GSH在皮肤接收液中线性关系良好，其线性回归方程为A=16 598c+5 257.4（r2=0.999 5）。在皮肤真皮匀浆液中GSH线性关系良好，其线性回归方程为A=5 360c-56 575（r2=0.999 5）。

3.1.2 稳定性 结果表明24 h内不同时间点的峰面积RSD为2.63%（n=6），表明GSH在透皮接受液生理盐水中稳定性良好。

3.1.3 精密度 结果表明日内精密度峰面积RSD分别为2.00%和0.95%（n=6），说明该仪器进样精密度良好。

3.1.4 回收率 结果表明皮肤匀浆高中低浓度GSH回收率分别为91.95%、95.85%、100.23%，RSD分别为0.41%、1.03%、1.27%（n=3），方法符合要求。

3.1.5 GSH在离体皮肤中的透皮吸收量 如图1-A所示，GSH组12 h药物累计透过量为125.81µg/cm2，而添加HA后的各组，GSH的透皮吸收均有所下降，7K、42K、90K、360K、920K组分别为92.03±6.64、61.12±4.12、35.21±3.19、29.93±7.58、16.04±3.63µg/cm2，统计学分析表明，游离GSH组与加了低相对分子质量7 000的HA组相比没有显著差异，与其他组相比则均有显著性差异（P＜0.05）。表明高相对分子质量HA可以阻碍GSH的透皮吸收，但7 000以下的低相对分子质量HA则没有影响。HA相对分子质量越大，GSH的经皮透过量越少，这可能与相对分子质量增加，HA溶液的黏度增加，阻碍了药物的经皮渗透有关［21］。

3.1.6 不同层次离体皮肤中GSH储留量 不同GSH与HA组处理大鼠皮12 h后，皮肤角质层与真皮层药物滞留结果如图1所示。从图1-B，1-C可以看出，相对分子质量为7 000，42 000，90 000的HA在角质层中对GSH均有显著性促进储留的作用，储留的GSH的量分别为对照组1.76、1.66和2.24倍，说明低相对分子质量HA可能借助其对皮肤的水合作用，也可能与GSH相互作用增强了其在角质层的滞留。在大鼠活性表皮和真皮层中GSH的储留量分别为对照组的1.52、0.92和0.64倍，相对分子质量最小的HA（7K）在活性表皮和真皮层的滞留量，与对照组和中高相对分子质量HA（90K、360K、920K）组相比有显著性差异，表明低相对分子质量HA能在一定程度上促进药物进入真皮深处。但是高相对分子质量HA（360K，920K）在角质与真皮12 h中的滞留分别仅为对照组的0.36，0.28；0.36，0.21倍，说明高相对分子质量HA可能由于其黏度过大，使GSH束缚在其空间结构中，限制了药物的渗透。总体来说（图1-D），高相对分子质量HA不利于GSH的渗透和滞留，低相对分子质量HA能够帮助其更好的进入角质以及更深处。

Figure 1 In vitro transdermal profiles of glutathione(GSH)permeated through rat skin(A)and retention amount of GSH in the stratum corneum of rat skin(B),epidermis and dermis of rat skin(C)and in the wholerat skin（D）(xˉ±s,n=3)HA:Hyaluronic acid*P＜0.05 vs GSH control group

3.2 ATR-FTIR对角质层的影响

表1为不同相对分子质量HA对大鼠皮肤角质层脂质以及角蛋白振动峰的位移变化，由表中数据可以看出，生理盐水对照组的脂质吸收峰为2 918.1和2 850.6 cm-1。而与对照组脂质吸收峰相比，高相对分子质量HA（360K，920K）对于脂质的影响较小，中相对分子质量与低相对分子质量HA（7K，42K，90K）均向长波方向移动，其中1%90K HA脂质峰位分别增加了4.2，2.2 cm-1，表明HA对脂质有一定的相互作用。对照组角蛋白NH-C=OⅠ、Ⅱ峰位分别为1 649.1，1 542.9 cm-1，与对照组相比，不同相对分子质量透HA的峰位均向短波方向移动，其中1%7K HA与1%42K HA最为显著，角蛋白峰位分别减少了5.4，3.3 cm-1与5.1，1.0 cm-1。这说明低相对分子质量HA能够使皮肤角质层中的角蛋白α-螺旋结构减少，转变为β-片层与无规则卷曲结构［22］，因此HA可以使得角蛋白堆积变得疏松，角质层对透皮药物的阻碍减小来达到促渗目的。

3.3 HE染色

HE染色结果见图2。8 h后生理盐水组的皮肤结构完整。被覆鳞状上皮完整，角质层完好无损，呈带状均匀分布在活性表皮之上，无角质层脱落或游离，胶原纤维束紧密排列；而不同相对分子质量HA组皮肤角化层结构不完整，疏松，脱离增厚现象较明显，一些区域外层的角质呈带状游离分布，间隙变大，并且HA相对分子质量越低，其水合作用越强，角质层越疏松，但除角质层外对其他皮肤结构则无明显影响。表明了HA可以增加皮肤角质层的水合作用，从而增大了角质层的细胞间隙。研究表明，低相对分子质量的HA可以通过受体介导（CD44）等作用进入皮肤中，Zhang等［23］证实了炎症性银屑病皮肤中过度表达的CD44蛋白可作为透明质酸载体的潜在靶点，以增加药物在皮肤中的蓄积。当HA进入角质层后，因角质层含水量比真皮层低（角质层含水量一般为15%～20%，而真皮层则含70%），因此其增加角质层的水合作用比较明显。而相对分子质量越高，进入皮肤能力越差，因此显示出从图2-B到图2-F的差异性。

Table1 Effect of HA with different relativemolecular weight on theshift of lipid and keratin vibration peak in rat skin stratumcorneum

3.4 分子对接

由图3可知，通过200次的构象搜索，获得了HA与GSH相互作用的不同能量构象。将接近的构象进行成簇分析，通过搜索对接结果可以得出：GSH与HA包合物最优构象簇A1为63次，第二优势构想A2为34次，且最优构象的结合能为-2.90 kJ/mol。结合模式分析显示，GSH可以与HA结合形成了5个氢键，氢键的结合代表两者具有较强的相互作用力，这可能也是HA阻碍GSH经皮透过的原因之一。

Figure 3 Molecular docking of the lowest docking energy conformation of HA with GSH(A)and energy distribution diagram of molecular docking results(B)

4讨论

HA广泛应用于外用制剂中，有报道认为其具有一定的药物经皮促渗透作用。Nashchekina等［24］研究表明，低相对分子质量HA能够有效增强在皮层上的递送。Kim等［25］制备了透明质酸/β-葡聚糖纳米凝胶，结果显示该制剂能够穿透角质层并沉积在真皮中。但这些报道中大部分研究的模型药物均为难溶性药物，而水溶性药物研究较少。因此本研究以水溶性的GSH为模型进行考察，并探究不同相对分子质量HA对GSH是否具有经皮促渗或皮肤储留作用，以及透明质酸在其中的作用机制。

根据傅里叶全反射红外光谱结果，低相对分子质量HA作用于角质层后，角质层角蛋白酰胺峰向低峰位移动，对脂质峰位没有显著影响。高相对分子质量HA作用于角质层后角质层角蛋白酰胺峰无显著性影响，脂质峰位向高峰位移动。说明HA对皮肤的作用机制主要是其结合于皮肤后会使皮肤角质层结构发生紊乱，低分子HA主要影响角蛋白，使其从α-螺旋结构转变为β-片层结构，中高相对分子质量HA主要扰乱角质层脂质。

GSH与HA的相互作用，通过分子对接研究得到了证实，两者能形成氢键，表明GSH能在制剂中与HA相互作用，使其不易于快速进入皮肤。而当HA发挥保湿作用，增加了皮肤的水合度后，药物与HA的结合则可以发挥储库作用，缓慢进入皮肤角质层和真皮层中。

GSH为极性化合物，水溶性好而较难透过皮肤角质层。加入HA后，由于HA与GSH强烈的相互作用，阻碍了其快速进入皮肤，但低相对分子质量的HA则相对于高相对分子质量的HA表现出更好的角质层和真皮层的药物储留作用［26］。已有研究表明，低相对分子质量（特别是几千相对分子质量）HA比高相对分子质量HA更容易穿透皮肤［27］。因此，低相对分子质量HA进入皮肤的量比高相对分子质量HA更多，与角质层蛋白和脂质作用更明显，从而表现出了较好的药物透皮促进或储留能力。

本研究证实了不同相对分子质量的HA对于GSH透皮吸收和皮肤储留有显著的影响，并且不同的相对分子质量影响不同。这种阻碍药物透皮吸收、但促进皮肤储留的作用对于皮科制剂和化妆品中的有效成分（如抗皮肤真菌类药物、防晒、保湿和美白的功效成分等）进行配方筛选和研究，发挥其在不同皮肤层次的药物疗效有一定的指导意义。