气相色谱质谱法测定奶粉中3-氯丙醇酯影响因素

伍涛，薛麟，金志浩，孙洁

中检科（上海）测试技术有限公司/中国检验检疫科学研究院华东测试中心（上海 201206）

氯丙醇酯（3-MCPD酯）是近年来发现的一种新型污染物质，对于人体具有潜在的致癌作用[1]，在含有油脂的食品中以及食用油中污染水平比较高[2-5]。3-MCPD酯在人体内经胰脂肪酶水解可转化为3-MCPD[6]，会对人体健康造成很大影响，引发内脏毒性、免疫抑制作用等潜在的致癌因素[7-10]。我国发布第四次中国总膳食研究中，氯丙醇酯污染及暴露评估，婴幼儿和成人3-MCPD酯的膳食暴露量是TDI（2.0 μg/kg体质量）值的5～20倍，健康风险极高。

由于3-氯丙醇酯（3-MCPD酯）的前处理步骤复杂，而且所用到的试剂和耗材较为昂贵，通过前期试验发现影响其试验结果的因素有许多，若是不加以控制，会导致人力物力资源的浪费。故选择试验过程中几个可能对结果造成影响的关键点，对此进行分析，通过改变一些参数条件，根据改变参数后得到的试验数据，寻找把控措施，以确保试验结果的准确性。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

气相色谱串联质谱仪，Thermo ISQLT；电子天平，Sartorius，型号BSA124S；数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司，型号KQ-800DE型；氮气浓缩仪，POLYTECH普立泰科，型号EVA32；涡旋浓缩仪，上海爱朗仪器有限公司；高速离心机，CENCE湘仪，型号H1850。

1.2 试剂和材料

甲醇，色谱纯CNW；2甲基叔丁基醚，色谱纯CNW；甲醇钠，色谱纯CNW；冰乙酸，分析纯CNW；乙酸乙酯，色谱纯CNW；正己烷，色谱纯CNW；乙腈，色谱纯CNW；无水硫酸钠，分析纯CNW；溴化钠，分析纯CNW；七氟丁酰基咪唑，分析纯MACKLIN麦克林。硅藻土小柱，CNW。

1.3 标准品

3-氯-1,2-丙二醇（3-MCPD）标准品，Catalog No.1ST 7911-100E，Lot No.S 015579；D5-3-氯-1，2-丙二醇（D5-3-MCPD）标准品，Catalog No.1ST 7911D5-100E，Lot No.S 008417；3-氯-1,2-丙二醇棕榈酸双酯（3-MCPD棕榈酸双酯）标准品，Catalog No.B515200，Lot No.1-EJB-84-1；D5-3-氯-1,2-丙二醇棕榈酸单酯（D5-3-MCPD棕榈酸单酯）标准品，Catalog No.P156502，Lot No.14-AZC-178-2。

1.4 方法

1.4.1 样品预处理

称取5 g样品于100 mL烧杯中，加热水溶解。加10 mL氨水，搅拌混匀封口，放入65 ℃水浴中水解30 min。冷却至室温后加入10 mL乙醇、30 mL无水乙醚和30 mL石油醚，充分振摇3 min。将上层有机相转入已恒重的脂肪瓶中，重复提取1次。旋蒸蒸干有机试剂，放入烘箱烘干，冷却至室温后称其质量，脂肪瓶前后差值/样品称样量×100%，即为脂肪含量。

1.4.2 样品水解

准确称取0.1 g（精确至0.1 mg）上述油脂于10 mL玻璃管中，加入D5-3-MCPD内标溶液，加2 mL甲基叔丁基醚/乙酸乙酯混合溶液（8∶2，V/V），涡旋混匀。加入1.0 mL甲醇钠/甲醇溶液（0.25 mol/L）反应10 min。加入3 mL 10%酸化溴化钠溶液停止反应，加入3 mL正己烷，涡旋1 min，弃去上层溶液。重复萃取1次，收集下层水相溶液。

1.4.3 样品净化

将下层水相溶液转入硅藻土小柱中，用30 mL乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液，用无水硫酸钠吸水干燥过滤，氮气浓缩至近干（不能全干，否则会对结果产生影响），用2 mL正己烷复溶，涡旋混匀。

1.4.4 样品衍生化

在上述溶液中加入50 μL七氟丁酰基咪唑，立即封口。涡旋混匀，于70 ℃保温30 min。取出，加2 mL氯化钠溶液（20%）洗去杂质，取有机相加无水硫酸钠干燥，供气相色谱质谱测定。同时做系列标准工作液的衍生化反应。

1.4.5 测定条件

色谱条件：色谱柱，TG-5MS（柱长30 m，内径0.25 μm，膜厚0.25 μm）；载气，氦气；流速1 mL/min；进样口温度250 ℃；进样量1 μL，不分流进样，不分流时间0.5 min；程序升温，50 ℃保持1 min，以2 ℃/min升至90 ℃，再以40 ℃/min升至270 ℃，并保持5 min。

质谱条件：电离能量70 eV；离子源温度250 ℃；传输线温度280 ℃。

2 结果与分析

2.1 氨水加入量对试验结果的影响

称取5 g奶粉样品，加热水溶解，加入不同量的氨水进行水解。脂肪回收率结果见表1。提取奶粉中脂肪的原理是用乙醚和石油醚抽提样品的碱水解液，蒸发去除溶剂，测定溶于溶剂中的抽提物质量。脂肪的提取对此次试验3-MCPD酯检测结果的数值没有直接的关系，但是样品中油脂提取的效率高低会间接影响试验的最终结果。通过分析样品碱水解这一步骤中氨水加入量对回收率的影响，找出最佳的加入量，确保油脂尽可能提取以及最终数据结果的稳定。由表1可以看到，脂肪的提取效率随着氨水加入量的增加而提高，当氨水加入量为10 mL时，脂肪提取率接近100%；之后继续增加氨水的加入量，其对结果影响已经不大，故氨水加入量的最佳选择为10 mL。

表1 不同氨水加入量时脂肪的回收率

2.2 甲醇钠的体积分数及酯交换时间对试验结果的影响

2.2.1 甲醇钠用量

方法采用甲醇钠进行碱水解。当加入1 mL甲醇钠/甲醇溶液（0.5 mol/L）时，试验结果不稳定，反应过程中有白色絮状物产生，疑似为甲醇钠溶度过高导致部分析出，影响试验结果。故分别比较0.5，1.0，1.5和2.0 mL甲醇钠/甲醇溶液（0.25 mol/L）水解5 min时的响应。

国际上测定3-氯丙醇酯（3-MCPD酯）的方法有酸水解法和碱水解法。此次试验采用碱水解法，即用甲醇钠/甲醇溶液来将酯转变为醇。通过试验分析，甲醇钠的体积分数不宜过高，否则部分甲醇钠析出，导致反应不充分，影响数据结果，故试验选择加入1.0 mL甲醇钠/甲醇溶液（0.25 mol/L）进行酯交换反应。

2.2.2 酯交换时间

加入甲醇钠/甲醇溶液后的反应时间对结果会有非常大的影响。加入1.0 mL甲醇钠/甲醇溶液（0.25 mol/L），反应时间为1，2，4，6，8，10，15，20和30 min，试验结果见图1。

由图1可见，随着反应时间的增加，3-MCPD酯的检测结果也在增大，在10～15 min期间检测结果到达最大值，往后随着时间的推移，结果有逐渐减小的趋势。这是因为碱水解是一个断链的过程，需要给予充分的时间来进行反应，同时3-MCPD随着时间变长，会部分分解。所以水解时间不宜过长，需要严格控制其反应时间，故试验选择10 min作为水解时间，以确保试验数据的准确性以及稳定性。

图1 酯交换时间对3-MCPD酯结果的影响

2.3 衍生化试剂加入量对试验结果的影响

试验采用七氟丁酰基咪唑作为衍生化反应的试剂，加入量为5，10，20，50和100 μL，试验结果见图2。选择此方法在于其易于批量处理样品且前期水解时间耗时相对较短，缺点在于衍生化之前一定要将水去除干净，否则七氟丁酰基咪唑衍生不完全。试验发现，七氟丁酰基咪唑不同的加入量对试验结果也有影响。3-MCPD酯与衍生化试剂的加入量呈一个正比例的关系，但考虑到试验成本等因素，故试验选择50 μL作为七氟丁酰基咪唑最佳加入量。

图2 衍生化试剂用量对3-MCPD酯结果的影响

2.4 工作标准曲线以及空白对于试验结果的影响

试验结果均满足参考范围的要求，工作曲线相关系数r=0.999 8，见图3～图6，试剂空白和阴性样品空白的结果均小于方法的检出限，不会对试验结果造成影响。

图3 3-MCPD酯工作曲线

图4 特征离子（253）

图5 特征离子（289.00，38.33%）

图6 特征离子（275.00，30.07%）

3 结论

试验建立了一个内标法测定奶粉中3-MCPD酯的气相色谱质谱方法，并对结果产生影响的条件因素进行分析，包括氨水加入量、甲醇钠的体积分数、酯交换的时间、衍生化试剂的用量，寻找出了最合适的试验条件进行分析。

目前，我国对于氯丙醇酯缺少很多把控措施，无疑增加了该污染物的风险。因此有必要加大监管力度，对其进行更加完善的风险评估。尤其是奶粉生产商，要从健康安全的角度出发，改善加工工艺，以降低氯丙醇酯的污染水平。