茯砖茶金花发酵剂的制备工艺优化

曹 霞， 刘永翔， 黄永会， 任锡毅， 邹 晓， 谭玉梅*

(1.贵州大学 生命科学学院/农业生物工程研究院， 山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室， 山地生态与农业生物工程协同创新中心， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州省农业生物技术重点实验室， 贵州 贵阳 550006)

0 引言

【研究意义】茯砖茶(Fuzhuan Brick Tea)属于一种后发酵黑茶，具有独特的品质和风味，至今已有超过600年的悠久历史，产销量在黑茶市场中占据着重要的地位[1]。茯砖茶具有健胃消食、降脂减肥、降血压等多种保健功效[2-4]。肖文军等[5-7]研究表明，茯砖茶具有降脂减肥的作用。黄群等[8]研究表明，茯砖茶对人体胃肠消化功能具有调理作用。茯砖茶因具有较多的保健功效和投资价值，越来越受商业人士的青睐[9]。茯砖茶制作流程包括黑毛茶制备、渥堆、气蒸、二次渥堆、发花干燥和成品包装等[10]。形成茯砖茶品质的最关键工艺是发花，该工艺是金花菌—冠突曲霉在茶叶中繁殖代谢的过程，该过程不仅能够改善茶叶的外观、色泽、香气及口感等，还能够产生对人体有益的活性代谢产物[11]。因此，金花菌的数量和颗粒的饱满度是决定发花品质的重要参数之一[12]。贵州的夏秋茶资源丰富，黑茶产业具有良好的发展前景，目前，贵州对黑茶的研究很少，且产品结构单一，贵州黑茶企业普遍存在发花周期短，发花过程容易污染，发花工艺不成熟，没有统一的制作标准等问题。有研究发现，人工接种可以改善茯砖茶品质，而金花菌发酵剂的制备是人工接种的关键。对茯砖茶金花发酵剂的制备工艺进行研究，对改善茯砖茶品质具有重要意义。【前人研究进展】目前，针对发花技术的改进，大多数采用人工接种液体发酵剂、孢子液、孢子粉和添加诱发剂[13]，这些制作方法都相对比较复杂，不适宜工厂化推广。【研究切入点】目前，大多数利用固体培养方法，该方法具有操作方便，储存时间长等优点。为此，采用固体培养方法，对茯砖茶金花发酵剂的制备进行研究。【拟解决的关键问题】通过单因素试验设计考察不同含水量、接种量与蔗糖含量对发酵剂产孢量的影响，并利用响应面法对发酵剂的配方进一步优化，以期缩短发花时间提高发花孢子浓度，为茯砖茶的工艺改良和品质提升提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种：金花菌—冠突曲霉(Aspergilluscristatus)，由中国科学院菌种保藏中心和贵州省农业生物技术重点实验室共同保存，中国科学院菌株保藏号：CGMCC 7.193；黑毛茶由贵州过江龙生态黑茶(集团)有限公司提供。

5%NaCl MYA培养基：称取酵母5 g、麦芽糖20 g、蔗糖30 g、NaCl 50 g、搅拌混匀，然后加琼脂1.5～1.7 g，蒸馏水定容至1 000 mL，混匀，121℃灭菌20 min，取出冷却后贮存备用。

仪器设备：高压灭菌锅，日本TomyKogyo公司；超纯水系统，Purelab公司；超净工作台、摇床、BSS300-WEI电子天平，德国赛多利斯；各种规格的移液枪，Eppendorf；常温冰箱，海尔集团；电热恒温培养箱、广口瓶、烧杯等其他小型仪器均为国产仪器。

1.2 方法

1.2.1 金花菌孢子悬浮液的制备 将活化后的金花菌接种至5%NaCl MYA培养基，28℃培养7 d；在超净工作台上刮取冠突曲霉孢子，放入无菌三角瓶内，倒入一定量的无菌水，放入适量灭菌的玻璃珠，150 r/min，震荡30 min；过滤菌液，利用血球计数板计数，保存于4℃冰箱备用[14]。

1.2.2 单因素试验 称取10 g黑毛茶，装于灭菌三角瓶内，添加不同含水量(20%、24%、28%、32%、36%、40%)，蔗糖含量(0、1%、2%、3%、4%、5%)及接种量(160 μL、200 μL、240 μL、280 μL、320 μL、360 μL)；除考察因素外，其余条件均为含水量28%，蔗糖含量2%，接种量为240 μL，温度28℃下培养10 d，取出，45℃烘干1 d，测量孢子量，确定各单因素最佳水平，3次重复。

1.2.3 金花菌发酵剂孢子浓度的测定 取1 g发酵剂，加入9mL无菌生理盐水，150 r/min下震荡30 min，2层纱布过滤，40 mL无菌水多次冲洗，将孢子液稀释100倍。用血球计数板计数。

孢子数(个/g)=总孢子数/(5×25×104)×100，式中5×25×104为血球计数板的格子数，100为稀释倍数。

1.3 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，以含水量(A)、蔗糖含量(B)及接种量(C)为试验因素，以孢子量为响应面值，进行3因素3水平响应面试验，其因素水平见表1。

表1 茯砖茶金花发酵剂制备的响应面试验因素及水平

1.4 统计分析

采用Excel和SPSS对试验结果进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 不同因素对金花发酵菌产孢量的影响

从图1可知，不同含水量、蔗糖含量及接种量的金花发酵菌产孢量变化。

2.1.1 含水量 水分含量是影响茯砖茶发花的重要条件之一[15]。随着含水量的增加，产孢量呈先增后减趋势。当含水量达32%时，其产孢量最大，为21.52×107个/g，比含水量为20%时高近10倍。说明含水量对发酵剂产孢量的影响较大。

图1 不同含水量、蔗糖含量和接种量的金花菌产孢量

2.1.2 蔗糖含量 蔗糖能为微生物提供能量及营养物质。当蔗糖添加量为2%时产孢量最大，为19.13×107个/g，比没有添加蔗糖的孢子含量高1倍多；当蔗糖添加量为3%时，产孢量缓慢下降，为17.21×107个/g，说明适宜的蔗糖含量有利于孢子产量的提高，但当蔗糖含量过大时，高浓度的蔗糖可能会形成一定的渗透压，抑制菌丝的生长，影响产孢量[19]。

2.1.3 接种量 当接种量为200 μL时，其产孢量为7.5×107个/g。接种量低时，孢子数较少，产孢量低。当接种量为320 μL时，产孢量最大，为17.74×107个/g；当接种量为400 μL时，发酵剂产孢量逐渐降低。这是由于当接种量过大时，孢子数较多，培养基中的营养物质不能满足微生物的需要，抑制了菌体的生长，因此产孢量呈下降趋势[14]。

2.2 响应面试验优化茯砖茶金花发酵剂的制备工艺

2.2.2 不同因素的交互作用 当等高线图形呈椭圆形时交互作用显著，呈圆形时交互作用不显著。通过模型回归方差分析表明，一次项A对发酵剂产孢量影响不显著(P=0.318 3)，而B(P=0.008 4)和C(P=0.005 7)对发酵剂产孢量影响显著；交互项AB(P=0.141 8)对发酵剂产孢量影响不显著，等高线接近圆形(图2)； AC(P<0.000 1)及BC(P<0.000 1)对发酵剂产孢量影响极显著，等高线接近椭圆形(图2)；二次项A2(P<0.000 1)、B2(P<0.000 1)及C2(P<0.000 1)对发酵剂产孢量影响极显著。由P值可知，各因素对发酵剂产孢量影响的顺序依次为接种量(C)>蔗糖含量(B)>含水量(A)。

表2 响应面试验各处理茯砖茶金花发酵剂的产孢量

图2 不同因素交互作用的响应面图和等高线图

2.2.3 最佳条件的确定及验证 在获得非线性回归模型后，为求得最大产孢量，所得回归拟合方程各自变量求一阶偏导数，求得次方程得到最大产孢量最优条件为A=0.005、B=0.025、C=0.046换算成实际值为含水量31.96%、蔗糖2.98%、接种量321.92 μL，预测的最大产孢量为27.36×107个/g。

将响应面优化后的发酵条件进行3次验证试验，其产孢量分别为2.63×108个/g、27.6×107个/g和26.9×107个/g，与预测结果27.36×107个/g基本一致，表明该模型准确性且实用性高，能够预测产孢量。

3 讨论

茯砖茶的发花工艺对茯砖茶的品质至关重要，与传统的自然发花相比，添加金花菌发酵剂能缩短散茶发花时间、有效抑制杂菌的生长。1991年，黄建安[16]将2种诱发剂YFJ1和YFJ2添加到茯砖茶中；2007年，杨秀芳等[17]将天然助花剂添加到茯砖茶中；2009年，张睿[18]发明了一款直投式红茶菌发酵剂；2012年，吕嘉枥等[19]发明了一种茯砖茶孢子粉；结果都发现对发花作用比较显著，并有利于产品和品质的改变，可以缩短发酵周期，且有降低杂菌的污染等作用。但由于在发花过程中外源物添加量过大，不适合工业化生产；2014年，罗冰[20]利用麸皮、碳源物质及NaCl等物质制备发酵剂；2018年，周国庆等[14]在前人研究的基础上优化了培养基配方，以含水量、氯化钠浓度及接种量制备液体培养基及对发花促进效果较好等。但是每次接种都需要洗金花菌的孢子液，储存时间也较短，不利于工厂化推广。

制备发酵剂要严格控制无菌环境外，影响发酵剂的内在因素也很多，其涉及到制备工艺的每个环节。其中含水量是影响发酵剂的重要条件之一，金花菌—冠突曲霉只有吸收了茶叶中的营养成分才能生长，营养和吸收都需要以水为介质[21]；贾洪信等[22]研究散茶发花主要因素发现，蔗糖处理对发花有一定的影响，加糖直接提供了冠突曲霉的营养条件且有利于发花，但大规模生产中加糖，发花成本较高；接种量是影响散茶发花的一个重要指标，欧阳梅等[23-25]在茯砖茶散茶发花的技术研究表明，菌液接种能提高发酵茶的有益菌数量，同时提高了茶叶的感官品质，是提高发酵茶质量和产量的有效途径[13]。但直接用菌液接种有可能加大污染几率、操作过程繁琐以及需要大量的菌液。

在前人的研究基础上，开发了新型发酵剂，通过单因素试验及响应面试验优化发酵剂最优配方。研究结果表明，茯砖茶金花发酵剂的最佳制备条件为以10 g黑毛茶为基质，添加含水量31.96%、蔗糖含量2.98%、接种量321.92 μL，28℃条件下，培养10 d，该条件下的产孢量可达27.36×107个/g。

4 结论

直接用黑毛茶为基质的发酵剂相对于利用麸皮等为基质要简单，使用便利、储藏时间长且成本更低，优化的工艺参数经济可行，孢子产量更高及发花品质较好，更加适宜进行工厂化推广应用，可为下一步茯砖茶散茶发花的工业生产提供基础。